ИЛМ

Контаминация в ПЦР
Причины контаминации
Основные правила предотвращения контаминации в лаборатории ПЦР
Контроли в ПЦР
Способы снижения риска контаминации
Методы экстракции нуклеиновых кислот

Лекция №4

Галымжан Сейтгалиев

Контаминация (лат. contaminatio; смешени

попадание в определенную среду какой-либо примеси, изменяющей изучаемые или используемые свойства этой среды.

Применительно к ПЦР контаминация может быть двух основных видов:

контаминация может проявляться в ложноположительных результатах ПЦР
возникновении неспецифических продуктов ПЦР.

При несоблюдении мер безопасности с течением времени в лаборатории могут накапливаться ампликоны, что приводит к появлению тотальной контаминации, когда ампликонами «заражена» лабораторная посуда, автоматические пипетки и лабораторное оборудование, поверхность лабораторных столов, одежда или даже поверхность кожи сотрудников лаборатории (часто бывает при автоклавировании амплификационных пробирок), что приводит к появлению систематических ложноположительных результатов.

Основные правила предотвращения контаминации в лаборатории ПЦР:

разделение функциональных рабочих зон

соблюдение поточности и направления движения анализируемых образцов

отдельные лабораторные халаты в каждой рабочей зоне

одноразовые перчатки без талька

наконечники для дозаторов с фильтрами, защищающими от аэрозоля

одноразовые пластиковые пробирки, посуда, наконечники

химическая и УФ-дезинфекция всех поверхностей рабочих зон

Кроме того, активно внедряется в практику ПЦР-лабораторий еще одно направление по предупреждению контаминации: введение в состав реакционной смеси для ПЦР фермента урацил-ДНК-гликозилазы (УДГ), который катализирует высвобождение урацила из урацил-содержащей одно- или двухцепочечной ДНК, но не действует на dUTP. Образующийся при этом абазический сайт блокирует работу ДНК-полимераз и весьма подвержен гидролитическому расщеплению при повышенной температуре и высоких значениях pH. Сам фермент также чувствителен к нагреванию и может быть инактивирован при температуре выше 70 °С.

Борьба с контаминацией РС продуктами предыдущих амплификаций состоит из трех этапов

Частичная или полная замена в реакционных ПЦР-смесях dTTP на dUTP, которая приводит к тому, что все получающиеся ампликоны содержат урациловые основания

Введение в реакционную смесь УДГ и добавление к протоколу этапа предобработки, например, 5 минут при 50 °С

Введение в протокол амплификации этапа температурной инактивации фермента, в результате которой происходит также гидролитическое разрушение ампликонов с выщепленным урацилом, например, 3 минуты при 95 °С

В результате внесения перечисленных этапов в протокол эксперимента все ампликоны с урацилом, попавшие в реакционную смесь из предыдущих амплификаций, перестают быть матрицами для ДНК-полимераз.

Другим способом инактивации ампликонов служит фотохимическое воздействие на молекулы ДНК. Для этого используют псорален или изопсорален, который активируется кратковременным облучением ультрафиолетовым светом. Модифицированные этими соединениями молекулы ДНК не могут участвовать в реакции амплификации. Однако, как известно, ни одна биологическая или химическая реакция не идет со 100%-й эффективностью. Кроме того, всегда остается риск кросс-контаминации от образца к образцу в процессе выделения НК.

В соответствии с нормативными документами РК в случае возникновения контаминации лаборатории проводят следующие мероприятия:

утилизацию всех находящихся в контаминированной зоне реактивов

утилизацию исследуемых материалов на всех промежуточных стадиях обработки (кроме исходной)

генеральную уборку, химическую и ультрафиолетовую дезинфекцию всех
поверхностей лабораторных помещений

дезинфекцию мебели, рабочих поверхностей, а также поверхностей корпу-
сов приборов и оборудования химическим методом и ультрафиолетовым
излучением

С точки зрения ультрафиолетовой дезинфекции помещения в условиях контаминации рекомендуется использование импульсной плазменно-оптической технологии, основанной на облучении объектов (воздуха, открытых поверхностей) высокоинтенсивными потоками ультрафиолетового излучения сплошного спектра, что приводит к фрагментации ДНК-ампликонов.

На сегодняшний день широкое применение получили импульсные ксеноновые установки серии «Альфа» НПП «Мелитта», Россия (передвижные, переносные и стационарные), использование которых рекомендовано Федеральными клиническими рекомендациями «Применение импульсных ультрафиолетовых установок в эпидемиологическом обеспечении медицинских организаций» (НАСКИ, 2015 г.). Установки имеют регистрационные удостоверения и могут быть использованы в медицинских 65 учреждениях, режим работы в зависимости от модели определен в Методических рекомендациях МР 3.5.1.0100-15 «Применение установок импульсного ультрафиолетового излучения сплошного спектра в медицинских организациях» (2015 г.).

Для химической обработки контаминированной лаборатории рекомендуются растворы с ферментативной активностью против ДНК, РНК и РНКазы, что значительно более безопасно с точки зрения работы персонала и коррозии приборов по сравнению с ранее используемыми растворами хлорсодержащих препаратов. Доступными для использования реагентами являются спреи и растворы производства AppliChem GmbH (серия ExitusPlus), Thermo Scientific (серия AWAY) и Invitrogen (серия Alert).

Порядок проведения деконтаминационных регламентирован нормативными документами Республики Казахстан. Контроль качества деконтаминации осуществляется посредством смывов с рабочих поверхностей и оборудования.

Требования к обработке помещений и обеззараживанию материала для предотвращения контаминации исследуемых образцов, реагентов, оборудования

Ежедневно в конце рабочего дня проводят текущую влажную уборку полов разрешенными к применению дезинфицирующими средствами

Рабочие зоны (помещения) лаборатории должны подвергаться ежедневному обеззараживанию ультрафиолетовым излучением в соответствии с руководством “Использование ультрафиолетового бактерицидного излучения для обеззараживания воздуха в помещениях” Р 3.5.1904-04., М.: 2005 после ее окончания

Каждая рабочая зона (помещения) лаборатории должна быть обеспечена промаркированным набором уборочного инвентаря, не допускается использование индивидуального уборочного инвентаря для уборки других помещений лаборатории.

Перед началом работы рабочую поверхность столов (биологических боксов) и оборудования обрабатывают 70%-ным этиловым спиртом

При использовании кондиционеров, ежемесячно проводят очистку и обработку радиаторной решетки кондиционера и накопителя конденсата 0,2%-ным раствором ДП-2Т с заменой фильтров

Не менее чем один раз в год осуществляют обработку автоматических дозаторов. Дозаторы разбирают, обрабатывают моющим раствором для удаления жирового загрязнения, после чего остатки моющего средства удаляются ветошью, смоченной водой. Затем проводят обработку 1 N соляной кислотой; время экспозиции - 1 ч. Остатки раствора тщательно удаляют ветошью, смоченной водой, и проводят обеззараживание влажных поверхностей ультрафиолетовым излучением в течение 1 ч. По окончании обработки дозаторы собирают и проводят калибровку в соответствии с прилагаемой инструкцией по пользованию дозаторами. Автоклавируемые дозаторы обеззараживают паром под давлением 1,7 атм. при температуре 120 ± 1 0С в течение 20 мин.

Остатки материала, инфицированного (подозрительного на инфицирование) микроорганизмами I-IV групп патогенности, использованную посуду, после дезинфекции регламентируемыми дезинфицирующими препаратами (если необходимо) собирают в закрывающиеся емкости (контейнеры) и передают на автоклавирование. Не допускается слив необеззараженных жидкостей в канализационную сеть

Порядок и режимы обеззараживания исследуемого материала, инактивации пробирок с ампликонами, использованных реагентов и рабочей одежды представлены в Приложениях 5 и 6.

При возникновении контаминации в помещениях лаборатории, использующей МАНК, немедленно останавливают работы и проводят мероприятия по ликвидации контаминации (Приложение 7).

При случайном открытии пробирок с продуктами амплификации (Рабочая зона 3) необходимо остановить работу, надеть перчатки (при их отсутствии), закрыть пробирки, заменить перчатки, провести мероприятия по ликвидации возможной контаминации (Приложение 7).

В лаборатории проводят внутрилабораторный контроль качества дезинфекции и проведенной деконтаминации ампликонов, путем исследования смывов с рабочих поверхностей оборудования и поверхностей помещений.

Действия при контаминации лаборатории, использующей МАНК,

нуклеиновыми кислотами и ампликонами

Сотрудников, проводящих мероприятия по деконтаминации, обеспечивают отдельными халатами (желательно одноразовыми), шапочками, одноразовыми бахилами и перчатками, одноразовой ветошью, емкостями для приготовления необходимых количеств моющих и дезинфицирующих растворов

Каждую зону лаборатории обрабатывают сотрудники, работающие в ней

Для обработки каждой зоны используют отдельный набор уборочного инвентаря, подвергаемы после уборки обработке регламентируемыми дезинфицирующими средствами.

Каждую зону лаборатории разбивают на участки уборки, например:
участок 1 - бокс биологической безопасности и оборудование внутри него;
участок 2 - внешние поверхности бокса биологической безопасности;
участок 3 - шкафы для расходного материала;
участок 4 - холодильники для хранения реактивов, образцов проб;
участок 5 - оборудование, которое используют в работе, но стоит вне бокса биологической безопасности;
участок 6 - поверхности помещения (стены, окна, батареи, потолок, двери и т.д.);
участок 7 - пол.

Обработку проводят от участка к участку последовательно. Каждый участок обрабатывают отдельной ветошью. Перед обработкой готовят моющие и дезинфицирующие растворы.

Поверхности каждого участка вначале обрабатывают моющим раствором для удаления жировых загрязнений, после чего остатки моющего средства удаляются ветошью, смоченной водой.

Затем на поверхность наносят на 30 мин 0,2%-ный раствор ДП-2Т или аналогичные ему растворы, разрешенные к применению для этих целей в установленном порядке. Остатки дезинфицирующего средства тщательно удаляют ветошью, смоченной водой.

После завершения указанной обработки проводят обеззараживание влажных поверхностей ультрафиолетовым излучением в течение 45 мин.

Мероприятия, описанные в пункте 7 и пункте 8, повторяют еще раз.

По завершении деконтаминации берут повторные смывы, которые исследуют на наличие нуклеиновых кислот и (или) ампликонов возбудителей инфекционных заболеваний, диагностика которых наиболее часто осуществляется в данной лаборатории, с учетом длины специфических фрагментов амплификации нуклеиновых кислот возбудителей, указанных в инструкциях по применению к набору реагентов.

Для проведения смывов используют отдельные стерильные зонды с ватным тампоном, которые смачивают в 0,9%-ный раствор натрия хлорида или ТЕ-буфере (10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА) и вращательными движениями протирают рабочие поверхности оборудования, мебели, дверных ручек, косяков, телефонов и т.п. в течение 10 - 15 с, особое внимание, уделяя помещениям совместного посещения работников зоны детекции продуктов амплификации и других сотрудников лаборатории (столовая, санузел и т.п.). После взятия смыва зонд помещают в микропробирки объемом 1,5мл с 300-400 мкл ТЕ-буфера или 0,9%-ным раствором натрия хлорида, вращают в течение 10-15 с, избегая разбрызгивания раствора, и, отжав избыток жидкости о стенки пробирки, удаляют. Полученные суспензии перемешивают на вортексе в течение 1 мин. Для постановки реакции амплификации используют необходимый объем жидкости в соответствии с соответствующей инструкцией по применению к набору реагентов. После получения результатов смывов оформляются протокол.

В случае получения в образцах смывов положительных результатов амплификации, обработку повторяют.

Загрязненный расходный материал (пробирки, наконечники, реактивы и т.п.) и контаминированный рабочий исследуемый материал (кроме исходного материала) обеззараживают через автоклавирование, в соответствии с п.1.Приложения 6

Случаи контаминации регистрируют в специальном журнале с указанием мероприятий по ее устранению и результатов внутрилабораторного контроля.

Проведение работ связанных с амплификацией нуклеиновых кислот до завершения деконтаминационных мероприятий в лаборатории не допускается.

К любому используемому в лабораторной практике диагностическому набору для выявления и идентификации того или иного возбудителя в биологических пробах предъявляют ряд универсальных требований.

чувствительный специфичный метод выявления возбудителя;
удобство и простота использования;
стабильность всех компонентов, необходимых для проведения анализа, в течение длительного времени;
воспроизводимость результатов анализа независимо от используемой серии набора реагентов;
минимизация влияния так называемого человеческого фактора.

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) и обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) для РНК-содержащих вирусов, обладающий высокой чувствительностью и специфичностью, предъявляет определенные требования к выполнению всех этапов постановки анализа, начиная от взятия клинического материала и заканчивая регистрацией продуктов амплификации. Ошибка на любом из этих этапов может привести к неправильному результату анализа и как возможное следствие к ошибочному диагнозу.
Использование как внешних, так и внутренних контрольных образцов позволяет контролировать не только все стадии прохождения реакции, но и ход амплификации в каждой пробирке с реакционной смесью.
При проведении ПЦР и ОТ-ПЦР для получения достоверных результатов, а также для стандартизации диагностических наборов в целом необходимо наличие контрольных реагентов.

Контрольные реагенты в ПЦР

Для удобства детекции и контроля эффективности амплификации в состав реакционной смеси могут быть включены дополнительные компоненты.

Положительный контрольный образец (ПКО)

представляет собой искусственно синтезированную олигонкулеотидную последовательность, строго соответствующую искомой. Соответственно, праймеры для ПКО и искомой мишени одинаковые, что позволяет удостовериться в работоспособности и сохранности компонентов РС, необходимых для нормального прохождения ПЦР.
ПКО является одним из специфических компонентов наборов реагентов. Оптимальным вариантом внешнего ПКО является использование в качестве последнего сертифицированной культуры выявляемого возбудителя. Вместе с тем в наборах, предназначенных, например, для выявления и идентификации возбудителей опасных и особо опасных инфекционных заболеваний, такой вариант ПКО значительно уменьшает возможность использования указанных наборов реагентов вне специализированных лабораторий, имеющих соответствующий уровень безопасности. В связи с этим в общем случае использование в качестве ПКО нативных возбудителей нецелесообразно.
ПКО позволяет удостовериться, что все компоненты, входящие в состав реакционной смеси, обеспечивают нормальное прохождение реакции

Отрицательный контрольный образец (ОКО)

включает в себя все компоненты реакции, но вместо клинического материала или препарата НК вносится соответствующее количество деионизованной воды или экстракта, не содержащего исследуемую ДНК. Отрицательный контроль необходим для проверки компонентов реакции на отсутствие в них ДНК или клеток возбудителя вследствие контаминации и исключения учета ложноположительных результатов.

Внутренний контроль

Препарат НК может содержать примеси ингибиторов, которые заметно снижают эффективность ПЦР, а в некоторых случаях могут приводить к полному отсутствию результатов исследования. Кроме того, возможны ошибки на этапе составления РС (например, не добавили какой-либо компонент или саму НК), несоблюдение температурного режима хранения наборов реагентов или отдельных их частей (например, размораживание и потеря активности ферментов) и ряд других технических моментов, которые напрямую влияют на результаты ПЦР. Поэтому становится необходимым контролировать ход амплификации в каждой пробирке с реакционной смесью. Для этого в состав РС вводят дополнительный внутренний контроль (ВК).
ВК – это искусственно сконструированный препарат ДНК или РНК, который имеет принципиально отличную от искомой олигонуклеотидную последовательность. Для ВК в состав РС вводят собственные, строго комплементарные праймеры. Концентрация ВК в РС должна быть такой, чтобы не составлять конкуренции для амплификации даже единичных искомых молекул НК.

Наличие ампликонов ВК является свидетельством нормального прохождения реакции амплификации. Если ампликоны искомой НК отсутствуют, но не образовались также и ампликоны ВК, можно сделать вывод о технологических нарушениях либо о наличии в анализируемом образце нежелательных примесей. В любом случае результат реакции следует признать недостоверным.

Добавление внутреннего контрольного образца на стадии выделения ДНК позволяет определить, насколько эффективно произошло выделение ДНК в каждой конкретной пробирке. Использование внутреннего контрольного образца именно на стадии выделения ДНК позволяет получить максимально полную информацию о возможной ошибке в работе. Так, при использовании его только на этапе амплификации можно судить лишь о присутствии или о наличии ингибиторов ПЦР в реакционной смеси, тогда как неэффективное выделение ДНК не будет обнаружено.

Если внутренний контрольный образец внести в реакционную смесь, то он станет такой же мишенью для отжига праймеров, как и ДНК искомого возбудителя инфекции. Размер продукта амплификации внутреннего контрольного образца подбирают таким образом, чтобы он был в 2 раза и более больше, чем ампликоны, образуемые от амплификации искомой ДНК микроорганизма. В результате при внесении ДНК внутреннего контрольного образца реакционную смесь вместе с испытуемым образцом независимо от наличия микроорганизма в биологическом образце внутренний контрольный образец станет причиной образования специфических ампликонов, но значительно более длинных (тяжелых), чем ампликон микроорганизма. Наличие тяжелых ампликонов в реакционной смеси будет свидетельством нормального прохождения реакции амплификации и отсутствия ингибиторов. Если ампликоны нужного размера не образовались, но не образовались также и ампликоны внутреннего контрольного образца, можно сделать вывод о наличии в анализируемом образце нежелательных примесей, от которых следует избавиться, но не об отсутствии искомой ДНК.

К сожалению, несмотря на всю привлекательность такого подхода, у него есть существенный недостаток. Если в реакционной смеси находится нужная ДНК, то эффективность ее амплификации резко снижается из-за конкуренции с внутренним контрольным образцом за праймеры. Это принципиально важно при низких концентрациях ДНК в испытуемом образце, что может приводить к ложноотрицательным результатам.

Препараты геномной РНК не могут быть эффективно использованы в указанном качестве в силу их низкой стабильности [10]. Поэтому в качестве внутреннего контрольного образца при выявлении и идентификации РНК-содержащих вирусов с помощью ПЦР в последнее время широко используют так называемую армированную РНК [11, 14, 15, 17, 18]. В работе X.-F. Yu и соавт. [18] описано приготовление «армированной» РНК, используемой в качестве внутреннего ПКО в мультиплексной тест-системе для выявления вирусов гриппа и вируса тяжелого острого респираторного синдрома с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени.

Методика приготовления «армированной» РНК включает следующие этапы:

получение выбранного кДНК-фрагмента геномной РНК возбудителя

получение ДНК-фрагмента, содержащего информацию о синтезе белка оболочки фага MS2

амплификацию указанных фрагментов и встраивание их в плазмиду pMS27

трансформацию рекомбинантной плазмиды клеток Е. coli, штамм BL21 (DE3)

индукцию экспрессии белка оболочки фага MS2 изопропил-β-D-тиогалактопиранозидом

осаждение клеток Е. coli

инкубацию супернатанта с избытком ДНКаз и/или РНКаз

проверку полученного продукта с помощью электрофореза

очистку полученного комплекса РНК–белок с помощью электроэлюции в агарозном геле

проверку конечного продукта в ОТ-ПЦР в реальном времени

Конечный продукт представляет собой фрагменты специфических РНК, упакованные в белок оболочки фага MS-2 («армированную» РНК).

Универсальный внутренний контрольный образец добавляют в количестве 10 мкл препарата в 300 мкл лизирующего раствора непосредственно перед добавлением пробы. Дальнейшее выделение ДНК происходит по обычной методике. После регистрации продуктов амплификации полоса, соответствующая внутреннему контрольному образцу, должна проявиться во всех пробах, в которые был добавлен препарат. Отсутствие этой полосы может свидетельствовать об ошибках на стадии выделения ДНК либо на стадии амплификации ДНК. В таких случаях необходимо поставить ПЦР с ДНК, выделенной из той же пробы еще раз, при повторном отсутствии полосы внутреннего контрольного образца необходимо провести повторное выделение пробы.

ВК может быть использован не только непосредственно в составе РС для амплификации, но и для контроля качества выделения НК. Для этого его вводят в каждую пробирку с исходным или предварительно обработанным образцом, проводят через этап выделения и только потом добавляют в РС. Введение ВК с известной концентрацией на этапе выделения особенно важно для контроля количественного ПЦР-анализа.

Специальные контроли

Использование специальных контролей при постановке ПЦР позволяет решить ряд задач, в первую очередь касающихся оценки эффективности процесса амплификации и контроля специфичности полученных результатов, а также дает возможность реализовать подход к количественному анализу ДНК. Принципиальным моментом является постановка специальных контролей при исследовании сложных многокомпонентных систем, таких как биоценозы, поскольку появляется возможность качественного и количественного анализа взаимодействия компонентов системы и характеристики их отношения к биотопу.

К специальным контролям можно отнести следующие:

используются при детекции результатов ПЦР методом гель-электрофореза. Стандарты (маркеры) представляют собой фрагменты двухцепочечной ДНК строго определенной длины, позволяющие идентифицировать и охарактеризовать полосы, полученные в геле, и оценить результаты анализа с точки зрения их специфичности.

используется для ПЦР с флуоресцентными методами детекции результатов, причем данный тип контроля наиболее актуален для ПЦР с детекцией результатов по конечной точке (см. ниже). Анализ уровней флуоресценции искомой мишени и фоновой флуоресценции позволяет установить некоторое пороговое значение и определить критерии достоверности положительного и отрицательного результатов ПЦР с детекцией результатов по конечной точке.
Важно, что на величину фоновой флуоресценции могут повлиять:

свойства меченых зондов;
изменения концентрации отдельных компонентов реакционной смеси в зависимости от серии, режима и продолжительности хранения;
свойства используемого пластика;
особенности регистрирующей аппаратуры.

Поэтому фоновые пробирки должны готовиться в соответствии с инструкцией к применяемому набору реагентов, рекомендациями производителя и к каждой новой серии наборов реагентов.
NB !!! Фоновые пробирки в рамках одной серии могут быть использованы многократно, поэтому чрезвычайно важно соблюдать режим хранения, соответствующий режиму, определенному для всего набора реагентов.

наиболее часто используются при осуществлении количественного анализа методом ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени.
Стандарт – произвольный фрагмент ДНК или РНК, ограниченный теми же праймерами, что и для искомой мишени. Известные концентрации стандарта соответствуют определенным значениям порогового цикла Ct (номер первого цикла, в котором происходит увеличение флуоресцентного сигнала репортерной группы по сравнению с уровнем фонового сигнала; его величина зависит от исходного количества копий матрицы и от эффективности амплификации ДНК). Введение этого типа контролей предполагает построение калибровочного графика, из которого находят концентрацию искомой НК в исследуемом образце. Точность метода зависит от того, насколько условия ПЦР серии стандартов (прежде всего эффективность амплификации) близки к условиям ПЦР экспериментальных образцов.
Для определения количества матрицы в ПЦР-РВ существуют следующие варианты стандартов:

очищенный продукт ПЦР-РВ;
рекомбинантная ДНК;
рекомбинантная РНК с последующей обратной транскрипцией;
синтетический олигонуклеотид, содержащий амплифицируемую последовательность.

Использование стандартов и калибраторов позволяет определить концентрацию ДНК в двух вариантах (например, при анализе на наличие патогенных микроорганизмов в пробе):

количество геномных эквивалентов клеток микроорганизмов в единице объема клинического образца (ГЭ/мл), что отражает абсолютную концентрацию данных микроорганизмов в клиническом материале;
расчет соотношения количества геномов на количество геномов клеток человека.

Для этой цели в ПЦР-смеси наряду с калибраторами ДНК микроорганизма присутствуют калибраторы человеческой ДНК. Полученные таким образом относительные значения концентрации ДНК микроорганизма к ДНК человека
могут отражать плотность обсемененности искомыми микроорганизмами.

ключевой момент в определении качества взятой для исследования пробы. Данный подход позволяет исключить ошибки преаналитического этапа при исследовании биологического материала, содержащего клетки человека, и избежать получения недостоверных, ложноположительных или ложноотрицательных результатов ПЦР. Кроме того, он может быть использован для оценки количества геномной ДНК человека.

Таким образом, существует спектр подходов, обеспечивающий получение достоверных результатов, которые позволяют контролировать качество и эффективность прохождения ПЦР и оптимизировать работу лаборатории.

Методы экстракции нуклеиновых кислот в ПЦР

Практически все научные исследования в области молекулярной биологии на той или иной стадии включают этап выделения нуклеиновых кислот. Выделенные нуклеиновые кислоты затем используют в ПЦР (ОТ-ПЦР), секвенировании и для множества других задач, причем технологии выделения различаются не только по принципу своего действия, но и в зависимости от типа биоматериала и последующего применения экстракта.
Экстракция нуклеиновых кислот - один из важнейших этапов молекулярной биологии, который обычно используется во многих областях биологических и медицинских наук, поскольку эта процедура является отправной точкой в любом молекулярном диагностическом наборе

Выделение фенол-хлороформом

Суть методики заключается в смешивании клеточного лизата с фенолом, хлороформом и изоамиловым спиртом в пропорции 25:24:1 и последующем перемешивании и центрифугировании смеси. После проведения этих манипуляций получается раствор с двумя фазами: водной и органической, причем все липиды и жиры находятся в органической (нижней) фазе, белки — на границе фаз, а нуклеиновые кислоты — в водной (верхней) фазе 2 (Рис.1). Для повышения чистоты экстракта эти действия повторяют несколько раз. Если раствор будет иметь низкий pH, то ДНК перейдёт в органическую фазу, а РНК останется в водной фазе, что позволяет выделять РНК отдельно от ДНК.
Данный метод используется повсеместно, поскольку он не требует дополнительного сложного оборудования и имеет невысокую стоимость. Однако нуклеиновые кислоты, полученные таким образом, обладают невысоким качеством и зачастую требуют дополнительной очистки. Также эта технология имеет существенно меньший выход нуклеиновых кислот в сравнении с другими методиками.
Помимо качества экстракта, этот метод обладает ещё несколькими недостатками: он требует сложных манипуляций, которые могут привести к контаминации и потере образца, а сам процесс трудно автоматизировать. Также весь протокол занимает достаточно много времени

Выделение на спин-колонках

Технология выделения на спин-колонках — это усовершенствованный метод экстракции на частичках силики, предложенный американскими учёными в 1979 году 4. Они продемонстрировали, что в щелочных условиях и при повышенных концентрациях соли ДНК связывается с силикатами, и это позволяет отделить все остальные компоненты клетки от частиц силики со связанной ДНК. Спин-колонки сконструированы таким образом, что при нанесении клеточного лизата на колонку и последующем центрифугировании.
ДНК остаётся на колонке, а всё лишнее проходит сквозь неё (Рис.2). Затем ДНК промывают несколько раз и элюируют в пробирку для сбора образца.
Преимущества такого метода заключаются в повышенной чистоте и хорошем качестве выделенных нуклеиновых кислот, высокой воспроизводимости и простоте по сравнению с выделением фенол-хлороформом. Однако также большое количество манипуляций может привести к контаминации, а выделение коротких фрагментов ДНК на спин-колонках может быть затруднено 5.
Экстракция на спин-колонках может занять от 20 минут в зависимости от биоматериала и сложности его лизиса.
На рынке этот метод представлен большим разнообразием наборов от таких производителей, как Qiagen, Analytik Jena, NEB, ThermoFisher и других. Стоимость одного выделения здесь значительно выше, чем у предыдущего метода, поскольку на каждую реакцию необходима своя колонка, несколько пробирок для сбора фильтрата и элюата и, конечно, реагенты.

Выделение на магнитных частицах

Спустя 20 лет после появления метода выделения на спин-колонках начинает набирать популярность более быстрый способ выделения на магнитных частицах 6. Технология этого способа выделения основана на связывании нуклеиновой кислоты с веществом, покрывающим магнитные частицы (целлюлоза, сефадекс, сефакрил, dT-олигонуклеотиды, специфичные олигонуклеотиды и др.). К клеточному лизату добавляют такие магнитные частицы и перемешивают для связывания ДНК с ними. После этого пробирку ставят в магнитный штатив или подносят к магниту, фиксируя таким образом твердую фазу. После отбора супернатанта нуклеиновые кислоты на частицах промывают и элюируют .
Этот метод имеет те же преимущества, что и выделение на спин-колонках, но для экстракции на магнитных частицах не требуется сложное лабораторное оборудование (например, центрифуга). Более того, процесс выделения на магнитных частицах легко автоматизировать, и многие автоматические станции выделения основаны именно на этой методике 3. Однако здесь также присутствует риск контаминации и потерь образца.
Данный протокол выделения займет немного меньше времени благодаря отсутствию этапов центрифугирования, но количество манипуляций будет примерно таким же. Также стоимость одной реакции обычно выше, чем при выделении на колонках, а панели наборов предоставляют Qiagen, Analytik Jena, ThermoFisher и другие.

Умное выделение (Smart Extraction)

Методики выделения нуклеиновых кислот не перестают совершенствоваться: в 2005 году специалисты из компании Analytik Jena доказали, что для связывания нуклеиновых кислот с неорганической твёрдой фазой можно использовать не только хаотропные соли, но и смесь из хаотропных и нехаотропных солей с низкой ионной силой, эту технологию они назвали Dual Chemistry 8.
Позднее они усовершенствовали технологию Dual Chemistry при помощи немагнитных частиц с «умной» поверхностью 9. Для выделения используются специальные наконечники с этими частицами, которые надеваются на дозатор. При заборе клеточного лизата в наконечник нуклеиновая кислота из раствора связывается с частицами, затем следуют этапы промывки и элюции, в результате чего получается очищенная нуклеиновая кислота высокого качества.
Эта технология значительно ускоряет процесс выделения, а благодаря особенностям «умной» поверхности выход и качество нуклеиновых кислот
значительно превосходит все предыдущие методы. Данный способ экстракции очень легко автоматизировать, ведь носики со связывающими частицами подходят как для обычных лабораторных дозаторов, так и для различных автоматических станций выделения нуклеиновых кислот.

Ферментативное температурно-зависимое выделен

ие

Все вышеперечисленные методики имеют общую лимитирующую стадию — этап лизиса. Во всех технологиях используется SDS и протеиназа K для разрушения клеточных стенок и высвобождения нуклеиновых кислот. SDS является ингибитором ПЦР, именно поэтому необходимы множественные стадии промывки, которые повышают риск контаминации и приводят к потерям образца. Также более сложные для лизиса образцы могут требовать дополнительную долгую и трудозатратную пробоподготовку.
Специалисты из новозеландской компании MicroGEM (ранее известной как ZyGEM) ликвидировали проблемы, связанные с длительным и сложным лизисом и использованием вредных химикатов, благодаря применению очень эффективной термофильной протеиназы EA1 вместе с мезофильными гидролазами 10.
Процесс ферментативного температурно-зависимого выделения начинается со смешивания буфера и ферментов с образцом. При последующей инкубации при комнатной температуре гидролазы деградируют клеточные стенки. После этого пробирку нагревают до 75°C, что активирует работу протеиназы EA1, которая разрушает все белки и высвобождает нуклеиновые кислоты. Последующее нагревание до 95°C дезактивирует EA1, и после этого образец готов для дальнейшего исследования (Рис.5). Для особо загрязненных образцов вроде почвы или растений можно добавить этап очистки на колонке для избавления от ингибиторов.
Данная технология оптимальна для работы с малым количеством биоматериала, поскольку нет потерь нуклеиновых кислот. Также эту методику легко автоматизировать, она самая быстрая среди всех упомянутых способов выделения (от 7 минут) и включает меньше всего манипуляций. Стоимость одной реакции невысока, поскольку кроме реагентов не требуется никаких специальных расходных материалов.