Лекция 5
Галымжан Сейтгалиев

Активное использование методов молекулярно-генетической диагностики в практике клинико–диагностических и научных лабораторий обусловливает необходимость правильной организации работы с нуклеиновыми кислотами.

При планировании ПЦР лаборатории для клинико-диагностических исследований необходимо определится каким методом ПЦР будет проводить исследование лаборатория.
В основу функционирования ПЦР-лаборатории могут быть заложены три основных метода:

Планирование ПЦР-лаборатории
Выбор метода повлияет на общую стоимость проекта оснащения лаборатории. Помимо типа ПЦР-лаборатории, не менее важно определить
  • приблизительный пробопоток вашей будущей лаборатории.
  • какое количество анализов/тестов/реакций вы планируете выполнять в день/неделю/месяц в лаборатории?
Исходя из ожидаемого количества, можно заранее определить количество сотрудников/операторов, которые будут проводить реакции в лаборатории.
  • При строительстве новых или реконструкции имеющихся помещений лабораторию размещают в отдельно стоящем здании (изолированной части здания, этажа) с соблюдением требований
  • При отсутствии возможности размещения помещений лаборатории в виде отдельного блока допускается проведение исследований поступающего материала на базе действующей лаборатории (микробиологической, вирусологической, иммунологической и т.д.) при условии организации в ней самостоятельных или выделенных в составе других функциональных помещений рабочих зон, соответствующих этапам проведения анализа, поточности движения персонала и материалов.
  • Помещения лаборатории должны быть боксированными (боксы с предбоксами), соответствующим образом промаркированы (нумерация или название рабочих зон) и оборудованы приточно-вытяжной вентиляцией, водопроводом, канализацией, электричеством и отоплением, средствами пожаротушения, естественным и искусственным освещением и быть непроницаемыми для грызунов и насекомых.
  • Внутреннюю отделку помещений осуществляют кафелем (пол, стены) или краской (стены, потолок), устойчивой к действию моющих и дезинфицирующих средств, поверхности стен, пола и потолка в лабораторных помещениях должны быть гладкими, без щелей, легко обрабатываемыми.
  • В помещениях рабочих зон должны быть установлены бактерицидные лампы.

Рабочие зоны ПЦР-лаборатории
  • Окна должны быть плотно закрыты, возможно, использование светозащитных пленок из материала, устойчивого к действию используемых дезинфицирующих средств.
  • Использование жалюзи (из-за адсорбции ими пыли) запрещено.
  • Архитектурно - планировочные решения и размещение оборудования должны обеспечивать поточность движения исследуемого материала.
Лаборатория в соответствии с этапами проведения анализа должна включать следующий набор последовательно расположенных самостоятельных рабочих зон (помещений) или отдельно выделенных рабочих зон в составе других функциональных помещений, количество которых определяется используемыми МАНК (Приложение 1):
  • приема, регистрации, разбора и первичной обработки материала (Рабочая зона 1);
  • выделения (экстракции) нуклеиновых кислот (Рабочая зона 2);
  • проведения реакции амплификации и учета ее результатов при использовании гибридизационо – флуоресцентного метода детекции (Рабочая зона 3);
  • учета результатов реакции амплификации нуклеиновых кислот методом электрофореза и (или) гибридизационно - ферментным методом детекции (Рабочая зона 4-1).
Рабочая зона №1
  • прием материала
  • маркировка
  • регистрация в специальном журнале
  • первичная подготовка (концентрирование материала путем центрифугирования, фильтрации, иммуносорбции, суспендирование, перевод сухих и плотных материалов в жидкую фазу и т.д.)
  • объединение или разделение проб на аликвоты
  • обеззараживание и хранение проб
  • обеззараживание остатков исследуемого материала.
Допускается проведение в Рабочей зоне 1 приема, регистрации, разбора и первичной обработки материала, исследуемого другими методами диагностики (бактериологическими, вирусологическими, иммунологическими и т.д.).
Рабочая зона №2
  • выделение и очистка нуклеиновых кислот микроорганизмов из проб, подготовленных в Рабочей зоне 1
  • материал подлежит передаче только после обеззараживания в маркированных одноразовых микроцентрифужных пробирках объемом 1,5-2 мл с закрытой крышкой
Рабочая зона №3
Подзона 3а
  • приготовление реакционных смесей
  • проведение обратной транскрипции
Подзона 3б
  • амплификации нуклеиновых кислот
  • учет результатов амплификации при использовании гибридизационо – флуоресцентного метода детекции.
Рабочая зона №4
Подзона 4а
  • если для учета результатов используется метод электрофореза и (или) гибридизационно-ферментативный метод детекции
  • применение для регистрации результатов реакции амплификации секвенирования работы по очистке ампликонов
Подзона 4б
  • если учет реакции амплификации осуществляют с использованием ДНК-чипов
Вентиляция
В условиях жаркого климата разрешается установка кондиционеров в помещениях рабочих зон лаборатории, при условии их выключения на время проведения работ с использованием МАНК, с последующей дезинфекционной обработкой рабочего места.

Оборудование

Каждая самостоятельная рабочая зона должна быть оснащена минимальным набором соответствующего лабораторного оборудования в зависимости от их функционального назначения и риска контаминации, необходимым комплектом мебели, пластиковой и стеклянной посуды, расходных материалов, защитной одежды и уборочного инвентаря, используемых только в данном помещении.
Необходимый комплект лабораторного оборудования определяют с учетом используемых МАНК.
Лабораторная мебель, оборудование и принадлежности каждой рабочей зоны должны иметь маркировку указанной зоны (помещения), их применение в других рабочих зонах (помещениях) или для других видов исследований не допускается.
Оборудование и измерительные приборы, используемые в работе лаборатории, должны быть зарегистрированы в установленном порядке и исправны, иметь технический паспорт и рабочую инструкцию по эксплуатации, соответствовать нормам безопасности и электромагнитной совместимости. Не реже 1 раза в год измерительные приборы должны подвергаться метрологическому контролю (поверке).


Аптечка
Лаборатория должна быть обеспечена аптечкой стандартной комплектации для оказания первой медицинской помощи при авариях в соответствии с действующими санитарными правилами, регламентирующими безопасность работ с микроорганизмами I-IV групп патогенности.
Специалисты ПЦР-лаборатории
Исследование материала, содержащего (подозрительного на содержание) микроорганизмы I-IV групп патогенности, МАНК, осуществляют специалисты с высшим или средним медицинским или биологическим (ветеринарным) образованием, прошедшие подготовку на лицензированных курсах первичной специализации по работе с микроорганизмами I - II групп патогенности (опасности) (только при работе с данными микроорганизмами) или с микроорганизмами III-IV групп патогенности, получившие дополнительное специальное образование на курсах повышения квалификации по молекулярно-биологическим методам диагностики.

Поточность движения исследуемого материала, проб нуклеиновых кислот, продуктов амплификации
  • Забор материала, его предварительную обработку, хранение, перевозку и передачу на исследование в Рабочую зону 1 осуществляют согласно инструктивнометодическим документам, регламентирующих выполнение исследований для каждого вида возбудителя инфекций, инструкциям к наборам реагентов и в соответствии с СП 1.3.1285-03 и СП1.3.2322-08.
  • Передачу исследуемого материала в Рабочую зону 1 и проб при смежном расположении помещений Рабочих зон 1, 2, 3 (3а и 3б) – желательно осуществлять через шлюзовые передаточные окна, а в Рабочие зоны 4-1 и 4-2 - через передаточные окна.
Термоконтейнер
  • Перенос проб из одной рабочей зоны в другую, а также их хранение в данных помещениях рекомендуется осуществлять в плотно закрывающихся металлических (с возможностью опломбирования) или пластмассовых контейнерах (штативах), с их последующей обработкой регламентируемыми дезинфицирующими средствами после каждого использования.
  • При исследовании материала, подозрительного на зараженность микроорганизмами I-IV групп патогенности все манипуляции в Рабочих зонах 1 и 2, включая манипуляции, сопровождающиеся риском образования аэрозоля (встряхивание, центрифугирование и т.д.) при обработке материала и выделении нуклеиновых кислот, выполняют в боксах биологической безопасности II или III класса.
Хранение
  • По окончанию работы все объекты, инфицированные (подозрительные на инфицирование) микроорганизмами I-IV групп патогенности, помещают на хранение в холодильное (морозильное) оборудование (бытовые и промышленные холодильники (морозильники) и шкафы, холодильные камеры) на время проведения исследований.
  • Рабочее место и рабочие поверхности оборудования подвергают дезинфекции.
Требования к защитной одежде
При работе с микроорганизмами I - IV групп патогенности выбор типа защитного костюма (рабочей одежды и средств индивидуальной защиты) проводится в строгом соответствии с СП 1.3.1285-03 и (или) СП 1.3.2322-08 и определяется видом возбудителя, рабочей зоной, оснащением ее боксами биологической безопасности
  • Каждая рабочая зона (помещение) обеспечивается необходимым количеством комплектов спецодежды (комбинезон или пижама, медицинский халат, шапочка, одноразовые латексные (резиновые) перчатки и сменная обувь).
  • При работе в помещении детекции продуктов амплификации следует надевать одноразовые бахилы. Использование одежды из другой зоны запрещено. Рекомендуется использование одноразовой одежды.
  • Надевание и снятие защитной одежды производят в предбоксах. В каждом из них должен быть отдельный комплект защитной одежды и обуви. Наиболее загрязненной продуктами амплификации считается защитная одежда Рабочих зон 4-1 и 4-2, особенно, латексные (резиновые) перчатки, которые снимают в первую очередь.

Требования к обработке помещений и обеззараживанию материала

Обработку помещений проводят в соответствии с требованиями СП 1.3.1285-03 и СП 1.3.2322-08.
Ежедневно в конце рабочего дня проводят текущую влажную уборку полов разрешенными к применению дезинфицирующими средствами.
Рабочие зоны (помещения) лаборатории должны подвергаться ежедневному обеззараживанию ультрафиолетовым излучением в соответствии с руководством “Использование ультрафиолетового бактерицидного излучения для обеззараживания воздуха в помещениях” Р 3.5.1904-04., М.: 2005 после ее окончания.
Каждая рабочая зона (помещения) лаборатории должна быть обеспечена промаркированным набором уборочного инвентаря, не допускается использование индивидуального уборочного инвентаря для уборки других помещений лаборатории.
Перед началом работы рабочую поверхность столов (биологических боксов) и оборудования обрабатывают 70%-ным этиловым спиртом.
При использовании кондиционеров, ежемесячно проводят очистку и обработку радиаторной решетки кондиционера и накопителя конденсата 0,2%-ным раствором ДП-2Т с заменой фильтров.
Не менее чем один раз в год осуществляют обработку автоматических дозаторов. Дозаторы разбирают, обрабатывают моющим раствором для удаления жирового загрязнения, после чего остатки моющего средства удаляются ветошью, смоченной водой. Затем проводят обработку 1 N соляной кислотой; время экспозиции - 1 ч. Остатки раствора тщательно удаляют ветошью, смоченной водой, и проводят обеззараживание влажных поверхностей ультрафиолетовым излучением в течение 1 ч. По окончании обработки дозаторы собирают и проводят калибровку в соответствии с прилагаемой инструкцией по пользованию дозаторами. Автоклавируемые дозаторы обеззараживают паром под давлением 1,7 атм. при температуре 120 ± 1 0С в течение 20 мин.
Остатки материала, инфицированного (подозрительного на инфицирование) микроорганизмами I-IV групп патогенности, использованную посуду, после дезинфекции регламентируемыми дезинфицирующими препаратами (если необходимо) собирают в закрывающиеся емкости (контейнеры) и передают на автоклавирование. Не допускается слив необеззараженных жидкостей в канализационную сеть. Порядок и режимы обеззараживания исследуемого материала, инактивации пробирок с ампликонами, использованных реагентов и рабочей одежды представлены в Приложениях 5 и 6.
При возникновении контаминации в помещениях лаборатории, использующей МАНК, немедленно останавливают работы и проводят мероприятия по ликвидации контаминации (Приложение 7).
При случайном открытии пробирок с продуктами амплификации (Рабочая зона 3) необходимо остановить работу, надеть перчатки (при их отсутствии), закрыть пробирки, заменить перчатки, провести мероприятия по ликвидации возможной контаминации (Приложение 7)
В лаборатории проводят внутрилабораторный контроль качества дезинфекции и проведенной деконтаминации ампликонов, путем исследования смывов с рабочих поверхностей оборудования и поверхностей помещений.

Контроль качества проводимых исследований

В лаборатории, использующей МАНК в диагностических целях, проводят внутрилабораторный контроль качества проводимых исследований с периодичностью, зависящей от объема выполняемой работы и определяемой руководителем лаборатории, но не реже одного раза в квартал.
Лаборатория должна принимать участие, в установленном порядке, в мероприятиях (программах) по внешней оценке качества лабораторных исследований (ФСВОК и т.д.) по конкретным нозологическим формам не реже 1 раза в год.
Внутрилабораторный и внешний контроль качества лабораторных исследований осуществляют путем анализа шифрованных аттестованных контрольных панелей, содержащих "положительные" и "отрицательные" пробы.
При проведении внутрилабораторного контроля качества лабораторных исследований могут использоваться аттестованные на наличие аналита (его количества) панели производителей коммерческих наборов или внутрилабораторные аттестованные образцы, содержащие и не содержащие нуклеиновые кислоты конкретных возбудителей в различной концентрации, стабильные в условиях хранения.

Забор, предварительная обработка, хранение и перевозка материала на исследование

Забор материала, его предварительная обработка, хранение и перевозка, передача исследуемого материала в другие организации осуществляется согласно инструктивно-методическим документам, регламентирующим выполнение исследований для каждого вида возбудителя инфекций, инструкциям к наборам реагентов и в соответствии с СП 1.2.036-95, СП 1.3.1285-03 и СП 1.3.2322-08.
С целью предотвращения разрушения нуклеиновых кислот рекомендуется использование следующих транспортных сред в зависимости от вида исследуемого материала
транспортная среда N 1, содержащая:
NaCl 137 мМ, КСl 2,7 мМ, NaH2PO4 10 мМ,
К2НРO4 2 мМ,
сыворотка крупного рогатого скота 20%
транспортная среда N 2, содержащая:
сахароза 0,218 М,
КН2РО4 0,0038 М,
К2НРО4 0,0072 М,
БСА 1%
транспортная среда ESP, содержащая:
саркозил 1%;
ЭДТА 0,05 М;
свободная от нуклеаз проназа Е 1 мг/мл
специальные транспортные среды
разработанные и рекомендованные производителями наборов реагентов.
При необходимости длительного хранения и перевозки в отсутствии низкотемпературных холодильников рекомендуется использовать транспортную среду ESP. Исследуемый материал может храниться в среде ESP при температуре 25 ± 5 0С в темном месте в течение 10 дней.
  • Перевозку материала (предварительно обработанных проб) для исследования, а также его хранение осуществляют в соответствии с СП 1.2.036-95 в закрывающихся (с возможностью опломбирования) металлических или пластмассовых контейнерах, на дне которых размещают адсорбирующий материал (марлевая салфетка, ткань, вата и пр.), смоченный раствором дезинфицирующего средства.
  • Контейнер помещают в сумку-холодильник или во внешний термоконтейнер с хладагентами.
  • При соблюдении противоэпидемического режима возможна перевозка материала для исследования в металлическом термосе со льдом
  • Перевозку и хранение материала рекомендуется осуществлять в условиях «холодовой цепи» с обеспечением необходимого контроля установленного температурного режима при помощи термоиндикаторов.
  • В зависимости от используемой транспортной среды, вида исследуемого материала и температурного режима сроки перевозки и хранения материала могут варьировать в широком диапазоне.

Список рекомендуемого оборудования (расходных материалов)

и его примерное размещение в рабочих зонах (помещениях) лаборатории, использующей МАНК в соответствии с этапами проведения анализа
Программа разработана для самостоятельного обучения в удобное для вас время. На связи с вами будет преподаватель для проверки задания и передачи обратной связи, будет доступен общий чат курса
Рабочая зона 1
1. Бокс биологической безопасности III класса защиты или бокса биологической безопасности II класса защиты.
2. Центрифуга для пробирок объемом 5 - 100 мл до 3 тыс. об/мин.
3. Микроцентрифуга/вортекс.
4. Настольная центрифуга для микропробирок типа «Эппендорф» объемом 1,5 -2 мл до 10000g.
5. Твердотельный термостат для пробирок объемом 1,5 мл с диапазоном рабочих температур 25 – 100 0С.
6. Термостатируемый шейкер для пробирок.
7. Установка для фильтрования воды с набором фильтров.
8. Отдельный набор автоматических пипеток переменного объема.
9. Одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся микропробирки на 1,5 мл или 2,0 мл.
10. Одноразовые наконечники для пипеток переменного объема с фильтром до 200 и до 1000 мкл.
11. Штативы для наконечников, микропробирок объемом 1,5 мл.
12. Комбинированный холодильник с камерами, поддерживающими температуру от 2 до 8 0С и не выше минус 16 0С (для хранения исследуемого материала). Возможно, отдельное использование холодильника с камерой поддерживающей температуру от 2 до 8 0С и морозильника, с камерой поддерживающей температуру не выше минус 16 0С.
13. Морозильная камера на минус 70 0С (при необходимости, в случае длительного хранения материала).
14. Емкость с регламентируемым дезинфицирующим раствором.
15. Емкость с 70 % этиловым спиртом.
16. вакуумный отсасыватель медицинский с колбой-ловушкой для удаления надосадочной жидкости;
Рабочая зона 2
1. Бокс биологической безопасности II или III класса биологической защиты.
2. Микроцентрифуга/вортекс.
3. Настольная центрифуга для микропробирок типа «Эппендорф» объемом 1,5 -2 мл до 10000g.
4. Твердотельный термостат для пробирок объемом 1,5 мл с диапазоном рабочих температур 25 - 100 0С.
5. Вакуумный отсасыватель медицинский с колбой-ловушкой.
6. Отдельный набор автоматических пипеток переменного объема.
7. Одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся пробирки объемом 1,5 мл или 2,0 мл.
8. Одноразовые наконечники для пипеток переменного объема с фильтром до 200 и до 1000 мкл.
9. Одноразовые наконечники для пипеток переменного объема до 200 мкл.
10. Штативы для наконечников, микропробирок на 1,5 мл.
11. Холодильник с камерами, поддерживающими температуру от 2 до 8 0С и не выше минус 16 0С (для хранения наборов, предназначенных для выделения нуклеиновых кислот). Возможно, отдельное использование холодильника с камерой поддерживающей температуру от 2 до 80 С и морозильника, с камерой поддерживающей температуру не выше минус 16 0 С.
12. Холодильник с камерой поддерживающей температуру от 2 до 80 С (для хранения препаратов нуклеиновых кислот). Не допускается хранение препаратов нуклеиновых кислот в одном холодильнике с компонентами набора для выделения нуклеиновых кислот;
13. Емкость с дезинфицирующим раствором.
14. При исследовании материала, подозрительного на зараженность возбудителями III-IV групп патогенности, не образующими спор, допускается использование автоматизированного оборудования для выделения нуклеиновых кислот.
Рабочая зона 3
1. Бокс биологической безопасности II и III класса или настольный бокс с бактерицидной лампой (ПЦР-бокс; УФ-бокс).
2. Программируемые термоциклеры (персональные, многомодульные, с функцией амплификации в режиме «реального времени») и автоматизированные станции.
2.1. Выбор термоциклера или автоматизированной станции определяется методами амплификации нуклеиновых кислот и коммерческими наборами реагентов, используемыми в лаборатории, характером выполняемых задач и финансовыми возможностями.
3. Флуориметр (флуоресцентный детектор), только при использовании учета продуктов амплификации гибридизационо – флюоресцентным методом детекции по конечной точке.
4. Микроцентрифуга/вортекс.
5. Отдельный набор автоматических пипеток переменного объема.
6. Одноразовые полипропиленовые пробирки для амплификации объемом 0,5 (0,2) мл.
7. Одноразовые наконечники для пипеток переменного объема с фильтром до 10 мкл, 100 мкл и 200 мкл, свободные от РНКаз.
8. Штативы для наконечников, микропробирок на 0,5 (0,2) мл.
9. Холодильник с камерами, поддерживающими температуру от 2 до 80 С и от минус 180 С до минус 250 С (для хранения наборов, предназначенных для проведения обратной транскрипции и амплификации нуклеиновых кислот). Возможно, отдельное использование холодильника с камерой поддерживающей температуру от 2 до 8 0С и морозильника, с камерой поддерживающей температуру от минус 180 С до минус 25 0 С.
10. Емкость для сброса отработанных расходных материалов.
11. С целью автоматизации процедуры приготовления реакционных смесей для амплификации допускается использование автоматизированного оборудования для раскапывания реагентов.

Действия при контаминации лаборатории, использующей МАНК,

нуклеиновыми кислотами и ампликонами
1
 Сотрудников, проводящих мероприятия по деконтаминации, обеспечивают отдельными халатами (желательно одноразовыми), шапочками, одноразовыми бахилами и перчатками, одноразовой ветошью, емкостями для приготовления необходимых количеств моющих и дезинфицирующих растворов
2
 Каждую зону лаборатории обрабатывают сотрудники, работающие в ней.
3
Для обработки каждой зоны используют отдельный набор уборочного инвентаря, подвергаемы после уборки обработке регламентируемыми дезинфицирующими средствами.
4
 Каждую зону лаборатории разбивают на участки уборки, например:
участок 1 - бокс биологической безопасности и оборудование внутри него;
участок 2 - внешние поверхности бокса биологической безопасности;
участок 3 - шкафы для расходного материала;
участок 4 - холодильники для хранения реактивов, образцов проб;
участок 5 - оборудование, которое используют в работе, но стоит вне бокса биологической безопасности;
участок 6 - поверхности помещения (стены, окна, батареи, потолок, двери и т.д.);
участок 7 - пол.
5
 Обработку проводят от участка к участку последовательно. Каждый участок обрабатывают отдельной ветошью. Перед обработкой готовят моющие и дезинфицирующие растворы.
6
Поверхности каждого участка вначале обрабатывают моющим раствором для удаления жировых загрязнений, после чего остатки моющего средства удаляются ветошью, смоченной водой
7
Затем на поверхность наносят на 30 мин 0,2%-ный раствор ДП-2Т или аналогичные ему растворы, разрешенные к применению для этих целей в установленном порядке. Остатки дезинфицирующего средства тщательно удаляют ветошью, смоченной водой.
8
После завершения указанной обработки проводят обеззараживание влажных поверхностей ультрафиолетовым излучением в течение 45 мин.
9
Мероприятия, описанные в пункте 7 и пункте 8, повторяют еще раз
10
По завершении деконтаминации берут повторные смывы, которые исследуют на наличие нуклеиновых кислот и (или) ампликонов возбудителей инфекционных заболеваний, диагностика которых наиболее часто осуществляется в данной лаборатории, с учетом длины специфических фрагментов амплификации нуклеиновых кислот возбудителей, указанных в инструкциях по применению к набору реагентов.
11
Для проведения смывов используют отдельные стерильные зонды с ватным тампоном, которые смачивают в 0,9%-ный раствор натрия хлорида или ТЕ-буфере (10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА) и вращательными движениями протирают рабочие поверхности оборудования, мебели, дверных ручек, косяков, телефонов и т.п. в течение 10 - 15 с, особое внимание, уделяя помещениям совместного посещения работников зоны детекции продуктов амплификации и других сотрудников лаборатории (столовая, санузел и т.п.). После взятия смыва зонд помещают в микропробирки объемом 1,5мл с 300-400 мкл ТЕ-буфера или 0,9%-ным раствором натрия хлорида, вращают в течение 10-15 с, избегая разбрызгивания раствора, и, отжав избыток жидкости о стенки пробирки, удаляют. Полученные суспензии перемешивают на вортексе в течение 1 мин. Для постановки реакции амплификации используют необходимый объем жидкости в соответствии с соответствующей инструкцией по применению к набору реагентов. После получения результатов смывов оформляются протокол.
12
В случае получения в образцах смывов положительных результатов амплификации, обработку повторяют.
13
Загрязненный расходный материал (пробирки, наконечники, реактивы и т.п.) и контаминированный рабочий исследуемый материал (кроме исходного материала) обеззараживают через автоклавирование, в соответствии с п.1.Приложения 6.
14
Случаи контаминации регистрируют в специальном журнале с указанием мероприятий по ее устранению и результатов внутрилабораторного контроля.
15
 Проведение работ связанных с амплификацией нуклеиновых кислот до завершения деконтаминационных мероприятий в лаборатории не допускается.

Боксы биологической безопасности – общая информация

Бокс биологической безопасности (БББ) – это закрытое рабочее место, назначение которого в том, чтобы защитить и сотрудника, и биологический образец от контаминации.
Классы боксов биологической безопасности
Существуют три основных типа БББ (классы I, II, III), и каждый из них имеет свои конкретные рабочие характеристики и назначение. Если БББ классов I и II правильно обслуживают и если в них работают, правильно выполняя микробиологические методы, то они обеспечивают эффективную изоляцию и безопасные условия работы с микроорганизмами, относящимися к группам с умеренным и высоким рисками (уровни биологической безопасности 2 и 3). БББ класса III являются наиболее подходящими для работы с опасными агентами, для которых требуется изоляция уровня биологической безопасности 3 или 4.
Понятие "биологическая опасность" означает "инфекционный агент (его часть), представляющий потенциальную опасность для здорового человека, животного или растения в результате прямого воздействия: заражения или непрямого влияния – через разрушение окружающей среды". Центрами контроля заболеваний (США) (Centers for Disease Control) и национальными институтами здравоохранения (США) (National Institutes of Health) на основании лабораторной практики, используемых методик и современного оборудования для безопасной работы установлены уровни биологической опасности с 1 по 3, которые присваиваются в зависимости от применяемых в работе агентов и направлений деятельности лаборатории

БББ – специальное оборудование, оснащенное ULPA фильтрами и предназначенное для защиты оператора или одновременной защиты его и продукта от веществ, представляющих биологическую опасность. Термин может быть применим только к оборудованию, которое оснащается в соответствии с требованиями для классов I–III, регламентирующими конструкцию, скорость и распределение воздушных потоков, системы вытяжки.
Основные международные стандарты для БББ [2, с.5]:
американский стандарт NSF 49:2002, (US)
европейский стандарт EN 12469:2000, (EN)
австралийский стандарт AS 2252
японский стандарт JIS K 3800:2000

Классы боксов биологической безопасности
Существуют три основных типа БББ (классы I, II, III), и каждый из них имеет свои конкретные рабочие характеристики и назначение. Если БББ классов I и II правильно обслуживают и если в них работают, правильно выполняя микробиологические методы, то они обеспечивают эффективную изоляцию и безопасные условия работы с микроорганизмами, относящимися к группам с умеренным и высоким рисками (уровни биологической безопасности 2 и 3). БББ класса III являются наиболее подходящими для работы с опасными агентами, для которых требуется изоляция уровня биологической безопасности 3 или 4.

БББ I класса
Эти боксы характеризуются наиболее простой конструкцией. Аэрозоль, содержащий биологически опасные агенты, захватывается воздушным потоком, поступающим в рабочую зону бокса, и проходит через специальную систему фильтрования, обычно представляющую собой комбинацию префильтра и ULPAфильтра. БББ I класса эффективно защищают оператора и окружающую среду от агентов, представляющих биологическую опасность, но не защищают от загрязнения внешним воздухом продукт, с которым проводится работа. Эти изделия считаются устаревшими и в настоящее время их использование ограничено

БББ II класса, тип А (А1/А2)
Такие боксы характеризуются воздушным потоком, поступающим через открытое пространство перед рабочей зоной из окружающей среды (воздухозабор), который препятствует выбросу аэрозоля потенциально опасных агентов во внешнюю среду. В отличие от БББ I класса, входящий поток в таких боксах поступает в рабочую зону не сразу, а уходит в решетку воздухозабора, расположенную рядом с оператором. В результате предотвращается загрязнение продукта внешним воздухом. БББ II класса характеризуются вертикальным ламинарным (однородным) нисходящим потоком воздуха, который очищается ULPA-фильтром и поступает в рабочую зону, что гарантирует отсутствие в рабочей зоне бокса микрочастиц и предотвращает загрязнение продукта. Основное различие между БББ II класса заключается в процентном соотношении выходящего и рециркулирующего воздуха. Подобные боксы могут иметь разные системы вывода выходящего потока. Одни могут возвращать воздух непосредственно в лабораторию (ESCO: Airstream АС2
Все БББ II класса защищают оператора и окружающую среду от агентов, представляющих потенциальную биологическую опасность. Кроме того, эти боксы защищают продукт от возможного загрязнения и подходят для работы с микроорганизмами 1–3 уровней биоопасности.

БББ II класса, тип А (А1/А2)
Тип А – самый распространенный вариант БББ II класса. Более того, такие боксы – самые распространенные среди всех подобных изделий. В них выходящий воздух составляет 30% общего воздушного потока, а 70% забранного воздуха поступает на рециркуляцию в рабочую зону, создавая нисходящий поток. При эксплуатации боксов типа А в них создаются зоны повышенного давления, а выходящий воздух поступает непосредственно назад в лабораторию. ULPAфильтры эффективно очищают выходящий воздух от различных аэрозолей, но не задерживают химические испарения. Если в работе наряду с биологически опасными агентами используются токсичные химические вещества, подобные боксы использовать не рекомендуется. В БББ II класса типа А1 зоны повышенного давления непосредственно граничат с окружающей средой, а в боксах типа А2 (ESCO: Labculture LA2, Labculture Plus LP2, Infinity FC2) они дополнительно окружены специальными зонами пониженного давления. При непредвиденной протечке воздух из контрольной зоны повышенного давления, содержащий потенциально опасные вещества, не попадает наружу, а задерживается зоной низкого давления [1, с.3]. Поэтому БББ II класса типа А1 считаются устаревшими, а боксы типа А2 (рис.2) – максимально безопасными для работы.



Таким образом, сейчас БББ II класса типа А – это боксы типа А2, в которых 70% воздуха из зоны повышенного давления поступает на рециркуляцию в виде нисходящего потока, а 30% – проходит очистку НЕРА-фильтром и выводится наружу.
Существуют боксы для специфического применения, например, Cytoculture CYT предназначены для работы с препаратами для химиотерапии и цитотоксическими веществами; Labculture Lead-Shielded LS2 – специально для работы с радиоизотопами, используемыми в медицине; они обеспечивают радиационную и биологическую защиту
БББ II класса, тип В (В1/В2)
Главное отличие таких боксов в том, что их нужно обязательно подключать к внешней вытяжке с внешним вентилятором. Собственный вентилятор бокса типа В создает только нисходящий поток, а входящий поток воздуха через решетку воздухозабора, создающий динамический барьер для защиты оператора, обеспечивается внешним вентилятором. При отсутствии внешнего вентилятора воздух, содержащий потенциально опасные микробиологические агенты, будет поступать из рабочей зоны прямо на оператора. БББ II класса типа В рекомендуются главным образом при микробиологической работе с летучими химическими соединениями. Независимо от их наличия этот тип боксов характеризуется повышенным уровнем биологической безопасности по сравнению с типом А.

Поскольку в боксах типа В выходящий воздух подается непосредственно во внешнюю вытяжку, существует дополнительная гарантия безопасности оператора в случае непредвиденного нарушения работы ULPA-фильтра на выходе [2, с.7, 8]. Боксы БББ II класса типа В1 были впервые заказаны Американским национальным институтом рака. В этих боксах 30% воздуха из контрольной зоны направляется на рециркуляцию, а 70% – на выход. Если проводить все манипуляции у задней стенки рабочей зоны, в них можно пренебречь рециркуляцией.
Однако из-за ее существования проводить работы с использованием летучих химических соединений в данном типе бокса не рекомендуется [2, с.8]. В БББ II класса типа В2 (ESCO: Airstream AB2 (рис.3), Labculture LB2 (рис.4) рециркуляция воздуха отсутствует. Потоки воздухозабора и нисходящий очищаются ULPA-фильтром на выходе без рециркуляции.
Поскольку в боксах этого типа рециркуляция отсутствует полностью, они рекомендуются для микробиологических работ с использованием токсических химических веществ. Именно боксы типа В2 – наиболее безопасные среди всех БББ II класса. Система вытяжной вентиляции выходящего потока является дополнительной гарантией безопасной работы в случае непредвиденного сбоя в системе нисходящего потока и/или ULPA-фильтрации на выходе. В боксах БББ II класса типа В2 может быть дополнительно усилена функция защиты окружающей среды. Между ULPAфильтром, очищающим воздух на выходе, и в конечной точке выхода воздуха может быть установлена дополнительная система его очистки от химических соединений.
БББ III класса
Такие боксы (ESCO Airstream AC3 (АС-4В1) (рис.5, 6) обеспечивают уровень безопасности, который не может быть достигнут в боксах I и II классов. Все БББ III класса обычно имеют цельносварной каркас и абсолютно герметичную конструкцию. Работа осуществляется с помощью герметичных перчаток, встроенных в переднюю панель бокса. В боксе III класса обязательно поддерживается пониженное давление, что является дополнительной гарантией безопасности. Во всех БББ III класса поступающий воздух проходит очистку ULPA-фильтром, что обеспечивает защиту продукта и предотвращает кроссзагрязнение. Воздушный поток на выходе проходит очистку ULPA-фильтром и прокаливается. Альтернативный способ очистки выходящего воздуха – последовательная двойная U LPA-фи л ьт ра ц и я. Сбок у БББ III класса располагается шлюз, позволяющий переносить материалы в рабочую зону. Выходящий поток в таких боксах обычно поступает непосредственно в лабораторию, однако возможно подключение бокса и к общей вытяжке. В этом случае микробиологическая работа может проводиться с использованием токсических веществ. БББ III класса подходят для операций с микробиологическими агентами 1–4 уровней биоопасности [2, с.9] и часто используются при работе со смертельно опасными микроорганизмами.
Выбор БББ

При выборе в первую очередь следует ориентироваться на необходимый тип защиты: защита продукта; оператора от микроорганизмов 1–4 уровней биологической опасности или от воздействия радионуклидов и летучих токсичных химических веществ. Не следует работать с летучими или токсичными химическими веществами в боксах с системой рециркуляции воздуха, не подключенных к общей вытяжке, т.е. в БББ I класса, II класса типа А1, А2.
БББ II класса типа В1 подходят для работ с небольшим количеством летучих химических компонентов или радионуклидов. БББ II класса типа В2, имеющие систему выведения всего воздушного потока во внешнюю вытяжку без рециркуляции, незаменимы при микробиологических работах с использованием значительных количеств радионуклидов и летучих химических веществ.
Ежегодная сертификация (валидация)

Все БББ подлежат обязательной сертификации (валидации), проводимой только квалифицированными специалистами испытательной лаборатории, проверяющими и оценивающими работу бокса, функционирование и безопасность всех его систем согласно протоколам IQ, OQ и PQ. Рекомендованные сроки валидации: при инсталляции бокса в лаборатории, затем регулярно с периодичностью раз в год [2, с.14]. При оценке эффективности работы бокса проверяются герметичность, возможность утечки в ULPA-фильтрах, профиль скорости нисходящего потока, скорость потока у открытого пространства, соотношение разреженного давления и мощности воздушных потоков тестируются в рабочей зоне, работа системы сигнализации и блокираторов. Дополнительно проверяется возможность утечки в электросети, интенсивность освещения ламп дневного света и УФ-ламп, уровень шума и вибрации.
Расположение в лаборатории
Очень важно правильно выбрать место для установки БББ. В связи с тем, что скорость потока входящего воздуха у фронтального стекла такого бокса составляет примерно 0,45 м/с, целостность воздушного потока может быть нарушена колебаниями воздуха, возникающими при передвижениях людей по лаборатории, открывании и закрывании дверей, сквозняке из окон и т.п. Идеальное расположение БББ – вдали от путей перемещения персонала и вне всевозможных возмущений воздушных потоков.
По возможности необходимо оставлять 30-см зазор между стенками бокса и помещения для облегчения его технического обслуживания. Расстояние между крышей бокса и потолком помещения должно быть 30–35 см, что позволяет проводить корректные измерения выходящих воздушных потоков и замену фильтра на выходе
Сертификация для использования

БББ должны быть сертифицированы не реже одного раза в год. Бокс должен быть дополнительно сертифицирован, если его передвинули на другое место в лаборатории или если произошли какие-нибудь изменения в системе вентиляции помещения.
Обучение сотрудников

Сотрудники должны быть обучены правильному использованию БББ с особым вниманием к действиям или поведению, которые могут нарушить правильный поток воздуха внутри бокса или у его передней части.


This site was made on Tilda — a website builder that helps to create a website without any code
Create a website