Основные источники ошибок при проведении ИФА

Основные источники ошибок при проведении иммуноферментного анализа

Надежда Попова

Лабораторная посуда

Посуда для приготовления рабочих растворов
реагентов должна быть тщательно вымыта. Особенно это касается раствора
субстрата и конъюгата, так как даже следовые загрязнения синтетическими
моющими средствами и окисляющими реагентами могут сказаться на результатах анализа. Рекомендуется выделить и промаркировать отдельную посуду, дозаторы и использовать одноразовые наконечники для работы с растворами конъюгата и раствора субстрата (ТМБ).

Фильтровальная бумага

на которой простукивают планшет для удаления
мелких капель отмывочного раствора, должна использоваться однократно.

Ошибки при подготовке образцов к анализу

Размораживание

Если исследуемые образцы поступают в лабораторию в замороженном виде, их необходимо разморозить при комнатной температуре
(+18…+25 °С) и тщательно перемешать на вихревом или ротационном смесителе для разрушения градиента концентрации сывороточных компонентов, образующегося при размораживании. Следует иметь в виду, что неполное перемешивание размороженных проб является очень частым источником ошибок.

Центрифугирование

Перед проведением анализа необходимо визуально убедиться в гомогенности используемых образцов сыворотки (плазмы) крови. Присутствие в исследуемом образце сыворотки (плазмы) крови сгустков фибрина, осадка или взвешенных частиц может помешать точному отбору пробы дозатором. В таких случаях необходимо провести центрифугирование пробы и отобрать супернатант для исследования. Образцы сыворотки (плазмы) крови с признаками микробиологического пророста (неприятный запах, плесневые вкрапления, комковатый осадок и мутность) для анализа использовать нельзя из-за произошедшего в них ряда серьезных биохимических изменений.

Разведение исследуемых образцов сыворотки (плазмы) крови

В некоторых видах анализа предусматривается стадия предварительного разведения исследуемых образцов сыворотки (плазмы) крови. Отбор каждого образца и приготовление его серийных разведений должны проводиться отдельными одноразовыми наконечниками, что исключает незапланированный перенос анализируемого материала из одной пробы в другую. Это имеет принципиальное значение при определении ряда аналитов, уровень которых значительно колеблется в различных пробах (например, ХГЧ, аутоантитела и др.). Следует иметь в виду, что плотность сыворотки отличается от плотности буферных разбавителей, поэтому приготовленные разведенные пробы необходимо тщательно перемешать перед проведением анализа или для приготовления последующих разведений. Перемешивание проб должно проводиться аккуратно, без избыточного вспенивания, так как это может привести к разрушению лабильных аналитов. Если разведение проб проводится в лунках микропланшета, то его нельзя использовать повторно. Для этих целей также исключается использование планшетов с сорбированными антителами или антигенами.

Ошибки при подготовке компонентов набора к работе

Наиболее удобным для потребителя является использование таких наборов реагентов, в которых все компоненты полностью готовы к использованию. Однако зачастую большая или меньшая часть реагентов, входящих в состав ИФА-наборов, требует подготовки к анализу.

Растворение и разбавление реагентов. Дистиллированная вода

Качество дистиллированной воды, используемой для растворения и разбавления компонентов набора реагентов, играет важную роль в получении воспроизводимых и достоверных результатов. Например, приготовление отмывочного раствора на воде с примесью хлора и имеющей рН около 4,0 может приводить к десорбции иммобилизованных антител или антигена, снижать сигнал и увеличивать вариабельность результатов, т.е. ухудшать аналитические параметры набора реагентов. С этой проблемой наиболее часто приходится сталкиваться осенью и весной, что связано с ухудшением качества водопроводной воды. Дистиллированную или деионизованную воду, используемую для приготовления реагентов, нельзя хранить в металлических емкостях, так как загрязнение раствора субстрата ионами металла может привести к его порче. При длительном стоянии дистиллированной воды может наблюдаться образование бактериального осадка на дне и стенках емкостей, используемых для ее хранения. Поэтому желательно готовить свежие порции дистиллята каждые 2–3 дня. Для предотвращения пророста воды нельзя использовать азид натрия и другие консерванты.

Лиофилизованные препараты и компоненты наборов

При растворении лиофилизованных компонентов набора следует убедиться в отсутствии сухих частиц препарата на герметизирующей пробке, чтобы избежать его потерь при вскрытии флакона. Необходимо обеспечить точное внесение рекомендуемых объемов растворителя для сохранения предусмотренных производителем концентраций реагентов.

Раствор субстрата тетраметилбензидина (ТМБ)

Для отбора раствора субстрата тетраметилбензидина (ТМБ) нельзя использовать посуду и наконечники, которые находились в контакте с о-фенилендиамином (ОФД), так как это приведет к получению неправильных результатов.

Отмывочный раствор

Приготовленный к работе отмывочный раствор следует хранить при комнатной температуре (+18…+25 °С) не более 5 суток или при температуре +2…+8°С не более 30 суток. Рекомендуется готовить свежие порции отмывочного раствора, которые можно полностью израсходовать в день проведения анализа. При этом исключается появление бактериального пророста, являющегося причиной засорения каналов и шлангов промывающего устройства, а также обеспечивается сохранность исходных свойств раствора. Таким образом, наиболее предпочтительным является выбор таких наборов реагентов, все компоненты которых поставляются в готовом к использованию виде.

Температура реагентов

Во всех инструкциях по применению наборов реагентов указано, что перед проведением анализа все компоненты набора, а также используемые разбавители должны быть прогреты до комнатной температуры (+18…+25 °С). Внесение в лунки планшета холодных реагентов с очень большой вероятностью приведет к получению неадекватных результатов, особенно в методиках с короткой инкубацией из-за нарушения процесса установления равновесия в системе. Кроме того, вскрытие охлажденных флаконов с лиофилизованными препаратами, а также пакетов с планшетами может привести к их порче из-за конденсации влаги.

Нарушение правил хранения и использования подготовленных к работе компонентов набора

Калибровочные пробы и контрольная сыворотка

Калибровочные пробы и контрольную сыворотку после вскрытия флаконов следует хранить при температуре +2…+8°С не более 2 месяцев. Длительное стояние на рабочем столе открытых флаконов с калибровочными пробами и контрольной сывороткой может приводить к искажению результатов анализа из-за испарения или адсорбции влаги и изменения концентрации реагента. Это особенно заметно при дробном использовании набора для проведения 4-5 циклов определений, когда остатки калибровочных проб и контрольной сыворотки во флаконах не превышают 100-200 мкл. Как правило, концентрация аналита в них становится заметно более высокой. Поэтому сразу же после использования флаконы с калибровочными пробами и контрольной сывороткой следует закрыть крышками и поместить их в холодильник (или заморозить в аликвотах, если это указано в инструкции по применению набора).

Раствор субстрата тетраметилбензидина (ТМБ)

При хранении на свету, а также при контаминации раствора субстрата тетраметилбензидина (ТМБ) окислителями и ионами металлов может наблюдаться его самопроизвольное окрашивание голубой и синий цвета. Такой реагент нельзя использовать для проведения анализа из-за повышения фона, снижения чувствительности и диапазона определяемых концентраций аналита. Раствор субстрата тетраметилбензидина (ТМБ) после вскрытия флаконов следует хранить при температуре +2…+8°С в течение всего срока годности набора

Планшет с иммобилизованными антителами или антигеном

Основной причиной порчи лунок с иммобилизованными антителами или антигеном является повышенная влажность. Поэтому оставшиеся неиспользованными стрипы необходимо тщательно заклеить бумагой для заклеивания планшета и хранить в оригинальной упаковке при температуре +2…+8°С в течение всего срока годности набора.

Стабильность вскрытого набора

Дробное использование наборов со стрипированными планшетами является допустимой процедурой при их рутинном использовании. Тем не менее, следует иметь в виду, что реальный срок годности вскрытых наборов неизбежно снижается. При дробном использовании набора для проведения 4–5 циклов определений значительно возрастает вероятность случайной порчи входящих в него реагентов (пророст и испарение калибровочных проб и контрольной сыворотки, контаминация конъюгата, изменение связывающей способности лунок под действием влаги и т.д.), которую производитель просто не состоянии предусмотреть и предотвратить. Типичной проблемой в таких случаях становится также нехватка реагентов, особенно калибровочных проб, контрольной сыворотки и конъюгата, а анализ калибровочных проб при этом вынужденно проводится в монопликатах. Все это противоречит обеспечению системы контроля качества и снижает точность определения. Поэтому в каждой лаборатории желательно экспериментально уточнить возможность дробного использования того или иного набора, а также сократить до разумного минимума количество циклов повторных определений с использованием вскрытых наборов. Для обеспечения стабильности подготовленных к работе компонентов и исключения их перекрестного загрязнения следует соблюдать определенные меры предосторожности, а именно, использовать новые одноразовые наконечники, сократить пребывание реагентов на рабочем столе на свету, при комнатной температуре, особенно в открытых флаконах, а также строго соблюдать рекомендуемые условия их дальнейшего хранения.

Срок годности набора

Использование наборов с истекшим сроком годности является достаточно частым нарушением, встречающимся в отечественных лабораториях. Однако следует иметь в виду, что в этом случае фирма-изготовитель не может гарантировать сохранение качества своей продукции и достоверность получаемых заказчиком результатов.

Замораживание компонентов

Случайное замерзание конъюгата при транспортировке или при хранении набора приводит к резкому снижению его ферментативной активности и падению сигнала. В то же время, однократное замораживание калибровочных проб и контрольной сыворотки нередко является допустимой, а иногда и рекомендуемой процедурой, используемой для продления срока их хранения, что в обязательном порядке оговаривается в инструкции по применению набора. Выпадение солей из концентратов буферных растворов при низкой температуре является обратимым процессом и обычно не отражается на качестве
данного реагента. Для уточнения возможности хранения тех или иных компонентов набора в замороженном виде, необходимо свериться с инструкцией к набору.

Ошибки при проведении анализа

Случайные ошибки при внесении компонентов в лунки планшета

При проведении анализа могут наблюдаться случайные ошибки, допускаемые оператором (использование реагентов, не входящих в состав данного набора, нарушение последовательности внесения реагента, дозирование неправильных объемов, двойное внесение реагента или образца в одну лунку, отсутствие нужного реагента или образца в лунке и т.п.). Такие ошибки не носят систематического характера и не воспроизводятся в последующих экспериментах. Для того чтобы свести к минимуму количество случайных ошибок, необходимо визуально контролировать процесс внесения реагентов. При обнаружении ошибок испорченные лунки нельзя опорожнять и использовать заново. Их следует забраковать и провести анализ повторно. Необходимая точность внесения реагентов обеспечивается использованием стандартизованных и поверенных дозаторов, а также достаточным практическим опытом лабораторного персонала. Результаты анализа, их точность и воспризводимость не должны зависеть от того, кто из операторов выполняет анализ в данный день. При использовании одноканального дозатора следует использовать новый наконечник для каждого образца, а при использовании многоканального дозатора – новые наконечники для каждого реагента.

Проведение анализа в монопликатах

очень часто используется лабораториями для снижения стоимости одного исследования. Тем не менее, это не согласуется с принципами организации системы контроля качествa лабораторных исследований, так как является значимым фактором риска получения неправильных результатов. При анализе калибровочных проб, контрольной сыворотки и исследуемых образцов в монопликатах невозможно оценить реальную вариабельность получаемых данных, а также провести выбраковку неправильных или сомнительных результатов из большого массива. Анализ неизвестных образцов рекомендуется всегда проводить в дубликатах, чтобы иметь возможность повторить исследование при наличии разброса результатов для одной и той же пробы.

Перерывы в процессе внесения реагентов

Все работы по внесению реагентов в лунки должны проводиться ритмично и без больших перерывов. Например, если калибровочные пробы находятся уже в лунках, а анализируемые образцы еще не готовы, или вносятся партиями через определенные промежутки времени, то продолжительность инкубации для разных проб будет различной. Это приведет к изменению параметров связывания и искажению результатов. Желательно, чтобы время заполнения планшета каждым из последующих реагентов было максимально коротким (не более 2 минут) и примерно одинаковым. Нельзя оставлять незаполненными реагентами лунки в перерывах между различными стадиями анализа. Даже незначительное их высушивание, которое к тому же происходит в таких условиях неравномерно, может привести к неконтролируемому снижению сигнала. При вынужденных перерывах в работе можно на некоторое время положить планшет вверх дном на смоченный водой лист фильтровальной бумаги.

Отмывка лунок планшета

Оптимизация процесса отмывки лунок планшета является очень важным условием для получения воспроизводимых результатов. При использовании промывающего устройства следует иметь в виду, что слишком сильный вакуум при аспирации может подсушивать лунки, повреждать белковое покрытие и вызывать инактивацию фермента, а слишком слабый – оставлять в них капельки жидкости. При любом способе отмывки необходимо визуально контролировать равномерность заполнения лунок и полноту удаления отмывочного раствора. Удаление остаточных капель жидкости является необходимой процедурой, которую проводят постукиванием перевернутого планшета по расстеленному листу фильтровальной бумаги. Слишком долгое пребывание отмывочного раствора в лунках, а также увеличение количества циклов отмывки может приводить к падению сигнала и повышению вариабельности результатов

Стадия инкубации с раствором субстрата тетраметилбензидина (ТМБ)

При проведении этой стадии необходимо строго соблюдать температурные и временные интервалы, рекомендованные производителем Набора реагентов. Категорически нельзя сокращать продолжительность инкубации для уменьшения количества ложноположительных результатов, так как при этом невозможно выявить и устранить истинную причину их появления. Кроме того, это приводит к возрастанию числа ложноотрицательных результатов. Инкубация с раствором субстрата тетраметилбензидина (ТМБ) должна проводиться в темноте для того, чтобы избежать краевых эффектов на планшете.

Регистрация результатов

Последней стадией анализа является регистрация результатов, т.е. приборный этап. Измерение оптической плотности растворов в лунках должна проводиться своевременно, т.е. не позднее, чем через 15 минут после внесения стоп-реагента. Это связано с тем, что реакция окисления хромогена после внесения кислоты до конца не останавливается, а оптическая плотность растворов в лунках продолжает возрастать.
Таким образом, контролируемыми параметрами аналитического лабораторного этапа являются: дозирование реагентов, процессы, связанные с проведением реакции (перемешивание, термостатирование, продолжительность инкубации и т.д.), а также стадия регистрации и математической обработки результатов.

Как уже было сказано выше, основная часть проблем при работе с наборами реагентов, связана с ошибками, возникающими на долабораторном и аналитическом этапах. Тем не менее, иногда в лабораторию могут поступать наборы реагентов, которые изменили свои свойства в процессе их доставки потребителям. Эта проблема характерна для отдаленных регионов, куда продукция поступает с нарушением температурных и временных условий транспортировки (замерзание и оттаивание реагентов или нагревание их до недопустимо высокой температуры и др.). Иногда встречаются нарушения в комплектации набора, а также повреждение его внешней/внутренней упаковки и флаконов с реагентами. Все это является поводом для оформления рекламации на набор. Для того чтобы технологи фирмы могли провести анализ причин получения неудовлетворительных результатов, желательно, чтобы при оформлении рекламации заказчик предоставил распечатку с полученными данными и сохранил остатки набора. После рассмотрения полученных материалов фирма принимает решение о замене набора, или дает заказчику необходимые рекомендации по методике проведения анализа

Рекомендации по использованию наборов

-Проверить набор на предмет цельности, сухости, полноценности.
-Не используйте компоненты набора с истекшим сроком годности.
-Прежде чем начать исследование убедитесь в том, что все реагенты и исследуемые образцы подготовлены (промаркированы и разморожены).
-Набор следует хранить при температуре 2-8°С. Замораживание компонентов набора не допускается.
-Компоненты набора и исследуемые образцы перед использованием необходимо выдержать при комнатной температуре (18-25°С) в течение не менее 30 мин.
-Любое отклонение от инструкции может вызвать ошибку и оказать большое влияние на проведение анализа.
-Для получения надежных и стабильных результатов процесс исследования следует проводить от начала и до конца без перерывов.
-Перед использованием тщательно перемешайте реагенты во флаконах. Отбирайте из флаконов только необходимое количество реагентов.
-Не использовать реагенты из разных серий наборов.
-Закрывайте каждый флакон своей крышкой. Никогда не сливайте излишки
реагентов обратно во флаконы во избежание контаминации.

Рекомендации по постановке эксперимента

-Вносите реагенты как можно ближе ко дну лунки, но не касаясь наконечником поверхности, чтобы не повредить покрытия лунок.
-Избегайте попадания прямых солнечных лучей на планшет во вовремя работы.
-Во избежание испарения рекомендуется при инкубации закрывать планшет крышкой или заклеивать пленкой для заклеивания планшетов (кроме инкубации с раствором субстрата).
-Если допущена ошибка при внесении анализируемых образцов, нельзя, опорожнив эту лунку, вносить в неё новый образец. Такая лунка бракуется.
-Соблюдайте указанные в инструкции режимы инкубации и промывки.
Воспроизводимость в любом ИФА зависит от точности пипетирования, соблюдения времени и температуры инкубации, соблюдения последовательности и количества промывок.

Основные условия качественной промывки

-Заполняйте лунки промывающей жидкостью выше уровня вносимых реагентов.
-Максимально удаляйте промывающую жидкость
-Не допускайте высыхания лунок между операциями, вносите реагенты в лунки сразу же после завершения промывки.
-Соблюдайте количество промывок
-После промывки тщательно удаляйте остатки промывочного буфера из лунок, постукивая перевернутым планшетом о фильтровальную бумагу или марлевую салфетку.
Неправильная промывка может привести к завышенным результатам.

Условия проведения фермент-субстратной реакции

-Конъюгат, а затем раствор субстрата и стоп-раствор рекомендуется вносить в лунки планшета с той же скоростью и в той же последовательности, что и калибровочные пробы, контрольную сыворотку и исследуемые образцы.
-Инкубацию с раствором субстрата следует проводить в темноте. Раствор субстрата чувствителен к свету, его следует предохранять от воздействия прямых солнечных лучей, чтобы не допустить окрашивания из-за аутоокисления.
-Флакон с раствором субстрата следует закрывать сразу после использования.
-Если раствор субстрата ТМБ во флаконе приобрел голубоватую окраску (исходно он бесцветен), он становится непригодным для использования!

Внесение стоп-реагента

-После добавления стоп-реагента в лунку с субстратом смесь рекомендуется осторожно перемешать на шейкере или легким постукиванием по ребру планшета.
-Образовавшиеся пузырьки воздуха осторожно удалите запаянным или загнутым кончиком наконечника.
-Следует учитывать, что реакция окисления ОФД при добавлении серной кислоты до конца не останавливается. Поэтому оптическую плотность желательно измерять в течении 30 мин.
-Избегайте попадания стоп-реагента, содержащего кислоту или щелочь, в глаза, на кожу и слизистые оболочки. Если это все же произошло, промойте пораженный участок большим количеством проточной воды.

Сложности, возникающие при постановке иммуноферментного анализа

-Повышенные оптические плотности исследуемых образцов/калибровочных проб
-Низкая воспроизводимость
-Пониженные оптические плотности исследуемых образцов/калибровочных проб
-Отсутствие окраски

Причины повышенной оптической плотности исследуемых образцов/калибровочных проб

-Превышение времени инкубации нарушение температурного режима;
-Несоблюдение объемов вносимых в лунки конъюгата или субстрата;
-Испарение содержимого лунок во время инкубации;
-Недостаточная промывка лунок;
-Контаминация реагентов или исследуемых образцов;
-Субстратный раствор оказался на свету.

Причины пониженной оптической плотности исследуемых образцов/калибровочных проб

-Недостаточное время инкубации;
-Несоблюдение температурного режима;
-Неправильная промывка;
-Высыхание лунок в процессе проведения анализа;
-Использование реагентов из других наборов;
-Истечение срока годности набора;
-Повреждение поверхности лунки наконечником;
-Измерение оптической плотности при несоответствующей длине волны.

Причины отсутствия окраски

-Не внесен конъюгат или субстрат;
-Перепутаны реагенты;
-Недостаточное время инкубации;
-Использование реагентов из других наборов;
-Истек срок годности реагентов.

Низкая воспроизводимость

-Ошибки при внесении образцов и реагентов;
-Недостаточная промывка;
-Загрязнение образцов, реагентов или поверхности лунок;
-Повреждение поверхности лунки наконечником;
-Недостаточное перемешивание содержимого лунок планшета;
-Испарение содержимого лунок во время инкубации;
-Использование неаттестованных полуавтоматических пипеток или оборудования.
-Неудаленные пузырьки воздуха в лунках после добавления стоп-раствора;
-Краевой эффект вследствие неравномерного нагревания планшета или инкубации с субстратом на свету;
-Компоненты набора перед использованием не были доведены до комнатной температуры;
-Различие в молекулярной структуре определяемого вещества в пробе и стандартном растворе.

Ложноотрицательные результаты

-Недостаточная чувствительность тест-системы, нарушение условий их хранения, транспортировки;
-Технические ошибки персонала.
-Ареактивное носительство возбудителя без иммунологических проявлений (например, в первичном периоде сифилиса результаты серологических реакций могут оставаться отрицательными еще в течение 1-4 недель после развития клинических проявлений инфекции).
-Взятие крови в период сероконверсии (например, у 8,4% больных ВИЧ-инфекцией регистрируются ложно-негативные результаты выявления анти-ВГС. Причем у таких пациентов в процессе наблюдения может регистрироваться серореверсионный эффект, т.е. регистрация позитивного результата после серонегативного анти-ВГС периода).
-В терминальной стадии некоторых болезней при тяжелом поражении иммунной системы с глубокими нарушениями гуморального иммунного ответа.
-Среди больных онкологическими и аутоиммунными заболеваниями, лиц с иммунодефицитными состояниями и больных сифилисом. за счёт ревматоидного фактора, представляющего собой иммуноглобулин M против собственных иммуноглобулинов G человека, у новорождённых такие ложноположительные реакции могут возникать за счёт образования в организме ребёнка M-антител к иммуноглобулину G матери. Анти-ВГС могут изолированно циркулировать в крови пациента, который выздоровел после острого гепатита С (10-15%) или у которого произошла элиминация РНК ВГС в результате проводимой терапии,

Перекрестные реакции - одна из причин внелабораторных ошибок

При ряде заболеваний:
-системные заболевания соединительной ткани,
-некоторые опухоли,
-ревматизм,
-беременность.
До 70% больных с хроническим гепатитом С с наличием анти-ВГС IgM одновременно имели повышенный уровень ревматоидного фактора, который способствует появлению ложнопозитивных результатов. Происходит изменение соотношения белковых фракций крови, образуются неспецифические антитела, которые могут связываться в ИФА и давать ложноположительные результаты.

Проблемы при интерпретации результатов ИФА в диагностике гепатита С

В лабораторной практике врачей-лаборантов иногда встречаются ситуации, когда на тест-системах разных производителей при исследовании одного и того же образца сыворотки или плазмы крови регистрируются взаимоисключающие результаты анализа.
Сотрудникам лабораторий ИФА знакома ситуация, когда донора крови отстраняют от донорства на основании полученного и подтвержденного положительного результата анализа на антитела к ВГС. Через некоторое время этот же донор предъявляет претензии данной лаборатории в выдаче неправильного (ошибочного) результата анализа на основании того, что в другой лаборатории, работающей на тест-системах другого производителя, результат анализа на анти-ВГС – отрицательный.
Нередко ситуация носит прямо противоположный характер. На станции переливания крови в образце крови антител к вирусному гепатиту С не обнаружено и кровь идет в переработку. А при повторном исследовании в другой лаборатории и в тест-системах другого производителя в образце обнаруживают антитела к вирусному гепатиту С.
Следует обратить внимание, что порой, даже в наборах одного производителя получают взаимоисключающие результаты.

На чем же основаны такие различия в результатах?

Почти каждый производитель использует собственные антигены оригинальной конструкции в качестве подложки для иммуносорбента.

Качество проведения ИФА

Неправильная подготовка образцов сыворотки крови для анализа

При надлежащем качестве исследований методом ИФА в лаборатории процент образцов, «сложных для интерпретации результата» составляет, приблизительно, 1%. Но этот процент может быть значительно выше в связи с ошибками при постановке ИФА в лабораториях.

Меры по профилактике ошибок ИФА включают в себя расширение знаний в области биологии, химии, физики и информатики; соблюдение инструкции к изделию и обращение к производителю в случае возникновения вопросов по проведению ИФА. Выявление случайных погрешностей в ходе выполнения мероприятий по обеспечению контроля качества лабораторных исследований – предмет для оценки точности и воспроизводимости рутинного метода исследования конкретного аналита, проверки оборудования, повышения квалификации персонала. Выявление систематической погрешности не обязательно влечет за собой вопрос о замене рутинного метода, так как она может быть свойством комплекта лабораторного оборудования или свойством конкретного оператора, но ставит клиническую лабораторию перед необходимостью пересмотра диапазона нормальных значений того или иного аналита, относительно диапазона, указанного в инструкции к тест-системе.

При обнаружении ошибки на каком-либо этапе ИФА – преаналитическом, аналитическом, постаналитическом – она устраняется одинаковым образом:

Выявление, идентификация

Расследование (человеческий фактор, неустойчивая работа прибора, загрязнение растворов и т.п.),

Документирование (причина выбраковки анализа пациента, определение периодичности повторения ошибки и причин ее возникновения)

Устранение – естественное завершение процесса

Сложности диагностики гепатита С

1) «Сложные сыворотки» - сыворотки, показывающие разные результаты в тест-системах разных производителей.
2) Неопределенные или сомнительные результаты анализа.
-В тест-системах ряда производителей такие образцы расцениваются как положительные, а их оптическая плотность может варьировать от значений, не намного превышающих ОПКРИТ до очень высоких значений ОП. В тест-системах других производителей эти же образцы расцениваются как отрицательные.
-В некоторых тест-системах одного и того же производителя результат скрининга и подтверждающего теста иногда не совпадают.
-При достаточно высоком качестве исследований проблема взаимоисключающих результатов заключается не в качестве используемых тест-систем, а в проблемах диагностики в целом. В равной степени это относится, как к диагностикумам отечественного производства, так и импортного.

РЕКОМЕНДАЦИИ CDC (Centers for Disease Control and Prevention) Американского центра контроля и предотвращения заболеваний:

-Образцы с высоким КП обычно подтверждаются (более 95%). (Т.е. менее 5 из каждых 100 могут давать ложноположительные результаты).

-Более специфические тесты должны быть проведены, если показано - «условное или избирательное дополнительное тестирование». В более чувствительных тестах - иммуноблоте – тестируются образцы: имеющие низкий КП и\или принадлежащие лицам с высокой вероятностью инфицирования ВГС.

Если мы используем импортные наборы, то должны учитывать рекомендации, которые к ним прилагаются. Даже при таких высоких коэффициентах позитивности (Уровень КП, прогнозирующий достоверно положительный результат с вероятностью ≥ 95%), каждый 20-й положительный результат может быть ложноположительным. Регистрация в тест-системах разных производителей взаимоисключающих результатов вовсе не означает, что один из диагностикумов неудовлетворительного качества или то, что импортный производитель «лучше».

При составлении заключения по результатам исследования «сложного» образца предлагается опираться на интерпретацию результатов, введенную фирмой Chiron Corporation – производителя иммуноблота «CHIRON RIBA HCV 3.0 SIA», в которой указывается, что в отдельных случаях решение о наличие HCV-инфекции не может быть принято. Сомнительные результаты должны быть протестированы снова в период от 6 до 12 месяцев, чтобы установить, имеется ли увеличение реактивности. Причем тестировать, по возможности, одновременно два образца: вновь отобранный и тестировавшийся первоначально. Дополнительную информацию можно получить при исследовании сыворотки методом ПЦР.

По некоторым образцам нельзя прийти к консенсусу, т. к. нет надежных критериев, гарантирующих положительный или отрицательный результат по данным ИФА и иммуноблота. В качестве дополнительных критериев рассматриваются некоторые косвенные показатели:

-высокий сигнал в ИФА (величина R ≥ 3);

-повышенный уровень АЛТ;

-наличие в крови РНК ВГС;

-повышенный риск заражения ВГС и т.д.

Причины несовпадений результатов ИФА

Тест-система

а) Различия в используемых антигенах;

б) Различия в конструкции наборов;

Лабораторные ошибки

Как решается такая проблема на практике

Для примера обратимся к алгоритмам исследования на гепатит С, принятым Американским Министерством здравоохранения и Сферы услуг. Управлением по контролю за продуктами и лекарствами. Центром по оценке и изучению биологических препаратов (CBER).(U.S. Department of Health and Human Services. Food and Drug Administration) и Министерством здравоохранения и Сферы услуг. Управлением по контролю за продуктами и лекарствами. (CenterforBiologicsEvaluationandResearch (CBER) для службы крови и предупреждения рисков при тестировании доноров крови.
Окончательное решение при повторно положительном результате скринингового исследования принимается по результату подтверждающего теста.

Если повторно положительный результат анти-ВГС, идентифицируются предшествующие донации за 12 месяцев до последнего отрицательного результата в лицензированном мультиантигенном скрининговом тесте. Если ПЦР положительный образец, то идентификация донаций за 12 месяцев до положительного результата ПЦР

В течение 3 календарных дней после получения положительного результата ПЦР или повторно положительного результата анти-ВГС скринингового теста.

Должен быть использован лицензированный соответвующий подтверждающий тест. Соответствующий подтверждающий тест- это тест, содержащий все те же антигены, что и проведённый скрининговый тест.

Если текущая проба повторно положительна в анти ВГС скрининговом тесте и положительна по ПЦР, положительный результат ПЦР действует как положительный подтверждающий результат и нет необходимости проводить мультиантигенный подтверждающий тест на анти-ВГС

Оповестить кровеполучателей обо всех результатах лабораторных тестов в течение 45 календарных дней с момента выявления повторно положительного образца анти-ВГС или положительного ПЦР результата

Кроводачи, собранные более, чем за 12 месяцев до появления у донора положительного ПЦР результата, могут быть использованы

Служба переливания крови должна идентифицировать и оповестить реципиентов предыдущих кроводач, или письменно врачей реципиентов при необходимости.

Положительные результаты скрининговых тестов должны быть проверены с помощью наборов с высокой специфичностью. Неопределенный результат подтверждающего теста наблюдается у недавно инфицированных лиц, находящихся в процессе сероконверсии, изредка у пациентов с гепатитом С. Среди лиц с низкой вероятностью заражения ВГС может означать ложноположительный результат скринингового теста, что является наиболее частой интерпретацией.
Неопределенный результат ИФА расценивается как отрицательный, если в динамике значения КП при определении анти-ВГС не увеличиваются, не появляются антитела к другим белкам ВГС, не менее 3-х раз не обнаруживается РНК-ВГС, постоянно определяется нормальный уровень АЛТ, АСТ, клинические признаки отсутствуют. При необходимости необходимо применять инструментальные методы исследования, биопсию печени.