надежда попова
Основные источники ошибок при проведении иммуноферментного анализа
Преаналитический (долабораторный) этап включает в себя все стадии от назначения анализа клиницистом до поступления исследуемого образца в лабораторию на рабочее место, а именно: назначение анализа, отбор биологического материала, его обработку и доставку в лабораторию
Аналитический доприборный этап представляет собой все стадии
ручного или полуавтоматического анализа до момента регистрации
результатов
ручного или полуавтоматического анализа до момента регистрации
результатов
Приборный этап обычно является стадией регистрации результатов, но может также включать все процедуры, которые происходят с пробой при проведении автоматических видов анализа.
Постаналитический этап состоит из оформления бланка с результатами, интерпретации результатов лабораторного исследования, доведения результатов до лечащего врача и постановки диагноза. На постаналитическом этапе возможным источником ошибок может являться неправильное заполнение бланка с результатами, а также неверная трактовка полученных данных.
Общая схема классификации этапов анализа
Ошибки, возникающие на внелабораторном этапе анализа, составляют, в среднем, от 70% до 95% всех погрешностей, которые допускаются при проведении анализа. Именно они могут оказаться непоправимыми и полностью обесценить весь ход проводимых исследований. Поэтому правильная организация преаналитического этапа должна стать составной частью любой системы обеспечения качества лабораторного анализа. При получении, обработке и доставке образцов в лабораторию следует иметь в виду следующие факторы, которые могут быть как устранимыми, так и неустранимыми.
Биологические факторы, связанные с личностью пациента
Пол пациента
Для каждого пола имеются статистически значимые различия в целом ряде клинико-химических и гематологических показателей. В частности это относится к уровням стероидных и гликопротеидных гормонов (прогестерон, эстрадиол, тестостерон, 17-ОН прогестерон, ЛГ, ФСГ, ТТГ, СТГ, пролактин), транспортных белков (ССГ, ТСГ) и других биологически активных соединений (ТГ), определяемых иммунохимическими методами. В методической литературе имеется обширная информация по этому вопросу, кроме того, ее можно найти в большинстве инструкций по применению наборов реагентов. Однако следует отметить, что приведенные в литературе референтные интервалы следует рассматривать лишь как ориентировочные. Это связано с наличием конструктивных особенностей наборов реагентов различных фирм-производителей, а также с региональными и расовыми различиями в составе населения. Поэтому в каждой лаборатории рекомендуется установить собственные значения нормальных
уровней исследуемых показателей с использованием тех видов наборов реагентов, которые используются в рутинной практике клинико-диагностической лаборатории.
уровней исследуемых показателей с использованием тех видов наборов реагентов, которые используются в рутинной практике клинико-диагностической лаборатории.
Возраст пациента
Концентрации целого спектра аналитов зависят от возраста пациента и могут значительно изменяться от момента рождения до старости. Наиболее ярко возрастные изменения выражены для биохимических показателей (гемоглобин, билирубин, активность щелочной фосфатазы, содержание липопротеинов низкой плотности и др.), а также для ряда аналитов, определяемых иммунохимическими методами. К ним относятся половые стероидные и гликопротеидные гормоны, тиреоиды, АКТГ, альдостерон, ренин, соматотропный гормон, паратгормон, 17-оксипрогестерон, дегидроэпиандростерон, ПСА и др. Желательно, чтобы в каждой лаборатории имелись возрастные нормы для
каждого из исследуемых показателей, что позволит более точно интерпретировать полученные результаты.
каждого из исследуемых показателей, что позволит более точно интерпретировать полученные результаты.
Биологические ритмы
Существующие линейные хронобиологические ритмы (возраст пациента), циклические ритмы (циркадные и сезонные) и некоторые другие (менструальный цикл) могут существенно влиять на концентрации аналитов.
Циркадные ритмы аналита
(т.е. изменения его концентрации в течение суток), наиболее ярко выражены для кортизола, АКТГ, альдостерона, пролактина, СТГ, ренина, ТТГ, паратгормона, тестостерона и др. Отклонения концентраций от среднесуточных значений могут достигать 50%–400% и этот фактор обязательно должен приниматься во внимание. Например, циркадный ритм кортизола может являться причиной недостоверных результатов теста на толерантность к глюкозе, если он проводится во второй половине дня. Для того чтобы не затруднять процесс интерпретации результатов, отбор проб для анализа нужно проводить строго в определенное время суток, обычно между 9 и 11 часами утра. Следует иметь в виду, что референтные интервалы большинства аналитов, приведенных в справочной литературе, установлены именно для этого промежутка времени. При проведении специальных исследований, например, при установлении индивидуального циркадного ритма секреции гормона, в течение суток отбирается несколько проб анализируемого материала. В документах, сопровождающих такие образцы, необходимо указать точное время взятия каждого из них. На циркадный ритм могут накладываться индивидуальные ритмы – сна, еды, физической активности, которые не следует путать с действительно суточными колебаниями. Для того чтобы исключить индивидуальные ритмы при определении уровня аналитов, секретируемых порционно (соматотропин, ренин, вазопрессин, тестостерон, пролактин и др.), рекомендуется использовать смешанную пробу, полученную из нескольких (обычно двух-трех) образцов крови, взятых с интервалом
в 2–3 часа. В некоторых случаях следует учитывать сезонные влияния. Например, содержание трийодтиронина (T3) в сыворотке (плазме) крови на 20% ниже летом, чем зимой.
в 2–3 часа. В некоторых случаях следует учитывать сезонные влияния. Например, содержание трийодтиронина (T3) в сыворотке (плазме) крови на 20% ниже летом, чем зимой.
Беременность и менструальный цикл
являются нормальными
физиологическими процессами, которые сопровождаются значительными изменениями в выработке стероидных, гликопротеидных и тиреоидных гормонов, транспортных белков (ССГ, ТСГ), АКТГ, ренина, а также в целом ряде биохимических и гематологических показателей. Поэтому для правильной интерпретации результатов важно точно указать день менструального цикла или срок беременности, когда был отобран исследуемый образец крови. При проведении скрининга врожденных пороков развития плода по биохимическим показателям следует иметь в виду, что диагностическая чувствительность и специфичность данного вида исследования в значительной степени будет определяться комбинацией выбранных иммунохимических маркеров. Она должна быть различной на разных стадиях развития плода. Например, для первого триместра беременности наиболее предпочтительным является определение АФП, свободной ß-субъединицы ХГЧ и ассоциированного с беременностью белка А (РАРР-А), а для второго триместра – АФП, общего ХГЧ (часто обозначаемого как ß-ХГЧ) и свободного эстриола. Все указанные виды
анализов должны проводиться в строго рекомендуемые сроки беременности, а каждая лаборатория, занимающаяся скрининговыми исследованиями, должна располагать собственной постоянно обновляемой и пополняемой базой медиан уровней исследуемых маркеров для каждой недели беременности.
физиологическими процессами, которые сопровождаются значительными изменениями в выработке стероидных, гликопротеидных и тиреоидных гормонов, транспортных белков (ССГ, ТСГ), АКТГ, ренина, а также в целом ряде биохимических и гематологических показателей. Поэтому для правильной интерпретации результатов важно точно указать день менструального цикла или срок беременности, когда был отобран исследуемый образец крови. При проведении скрининга врожденных пороков развития плода по биохимическим показателям следует иметь в виду, что диагностическая чувствительность и специфичность данного вида исследования в значительной степени будет определяться комбинацией выбранных иммунохимических маркеров. Она должна быть различной на разных стадиях развития плода. Например, для первого триместра беременности наиболее предпочтительным является определение АФП, свободной ß-субъединицы ХГЧ и ассоциированного с беременностью белка А (РАРР-А), а для второго триместра – АФП, общего ХГЧ (часто обозначаемого как ß-ХГЧ) и свободного эстриола. Все указанные виды
анализов должны проводиться в строго рекомендуемые сроки беременности, а каждая лаборатория, занимающаяся скрининговыми исследованиями, должна располагать собственной постоянно обновляемой и пополняемой базой медиан уровней исследуемых маркеров для каждой недели беременности.
Физические и стрессовые нагрузки, а также положение тела пациента
оказывают значительное влияние на содержание таких аналитов, как кортизол, тестостерон, АКТГ, ангиотензин, альдостерон, ренин, пролактин, СТГ, ТСГ, миоглобин, катехоламины, вазопрессин и др. При анализе гормонов, концентрация которых может быстро изменяться в течение суток, например, тестостерона, рекомендуется использовать смешанную пробу, полученную из трех образцов сыворотки (плазмы) крови, отобранных
с интервалом в несколько часов. Отбор образцов крови для определения ряда аналитов, таких как альдостерон, эпинефрин, норэпинефрин, предсердный натрийуретический пептид, а также для оценки активности плазматического ренина, следует проводить в положении лежаи/или стоя при спокойном состоянии пациента. В документах, сопровождающих образец, должна быть сделана специальная отметка о времени и условиях получения пробы. Все специальные условия отбора исследуемых образцов, рекомендуемые для того или иного вида анализа, оговорены в методической литературе, а также в инструкциях по применению наборов и должны неукоснительным образом
соблюдаться.
с интервалом в несколько часов. Отбор образцов крови для определения ряда аналитов, таких как альдостерон, эпинефрин, норэпинефрин, предсердный натрийуретический пептид, а также для оценки активности плазматического ренина, следует проводить в положении лежаи/или стоя при спокойном состоянии пациента. В документах, сопровождающих образец, должна быть сделана специальная отметка о времени и условиях получения пробы. Все специальные условия отбора исследуемых образцов, рекомендуемые для того или иного вида анализа, оговорены в методической литературе, а также в инструкциях по применению наборов и должны неукоснительным образом
соблюдаться.
Диагностические и лечебные процедуры
такие как оперативное вмешательство, диализ и внутривенные вливания, пункции, биопсии, массаж, функциональные тесты (пероральный тест на толерантность к глюкозе, стимулирующие и ингибирующие тесты для оценки функциональной активности надпочечников и гипофиза), эндоскопия, ионизирующее излучение, иммуносцинтиграфия и др. часто оказывают влияние на результаты лабораторных исследований. Например, уровень ПСА в течение нескольких дней может быть повышен после массажа простаты или катетеризации мочевого пузыря. Любые манипуляции с молочной железой или тепловые процедуры (например, сауна) приводят к значительному возрастанию уровня пролактина. Для исключения этих факторов отбор образцов крови рекомендуется проводить до выполнения любых
лечебных и диагностических процедур.
лечебных и диагностических процедур.
Прием лекарственных препаратов
может отражаться на количественном содержании в организме целого ряда анализируемых показателей. Например, уровень ТТГ снижается при лечении допамином, концентрация общих и свободных фракций тиреоидных гормонов изменяется при введении фуросемида, даназола, амиодарона и салицилатов, а применение некоторых противоязвенных препаратов может повышать уровень пролактина у мужчин. Введение моноклональных мышиных антител для проведения сцинтиграфии, при лечении опухолей или при пересадке органов может приводить к появлению в крови пациента гетерофильных антител к IgG мыши (НАМА), которые являются фактором, искажающим результаты диагностических тестов с использованием моноклональных антител. Присутствие лекарственных препаратов в биологическом материале, например, контрацептивов, салицилатов, андрогенов и др., может специфическим (перекрестная реакция) или неспецифическим образом (интерференция) влиять на результаты лабораторных исследований при определении концентрации стероидных и тиреоидных гормонов, а также специфических связывающих белков крови. Поэтому проведение медикаментозной терапии, могущей искажать результаты анализа, следует назначать после взятия проб крови. При проведении лекарственного мониторинга точное время отбора образца крови является очень важным параметром для правильной интерпретации результатов исследования.
Широкий спектр лекарственной интерференции в ходе лабораторных
исследований рассмотрен во многих обзорах и книгах, а также в инструкциях по применению наборов. Чтобы исключить возможность получения ложных результатов, обусловленных применением лекарственных препаратов, рекомендуется консультироваться с клиницистами, а также использовать соответствующие электронные справочники.
Широкий спектр лекарственной интерференции в ходе лабораторных
исследований рассмотрен во многих обзорах и книгах, а также в инструкциях по применению наборов. Чтобы исключить возможность получения ложных результатов, обусловленных применением лекарственных препаратов, рекомендуется консультироваться с клиницистами, а также использовать соответствующие электронные справочники.
Диета и потребление жидкости
относятся к основным факторам,
оказывающим влияние на концентрацию большинства аналитов в клинической химии, а также некоторых биологически активных соединений, определяемых иммунохимическими методами. Например, кофеин обладает способностью ингибировать расщепление цАМФ, повышает активность плазматического ренина и концентрацию катехоламинов. Голодание приводит к увеличению содержания в образцах сыворотки (плазмы) крови кортизола и дегидроэпиандростеронсульфата, а бессолевая диета – к повышению уровня альдостерона в 3–5 раз. Для таких случаев разработаны специальные рекомендации по подготовке пациента к отбору образцов крови. Например, определение активности плазматического ренина должно проводиться при стандартном потреблении K+ и Na+, при этом также исключается назначение диуретиков, гипотензивных средств
и β-блокаторов, ограничивается курение и прием напитков, содержащих кофеин. Взятие образцов крови для определения концентрации ряда аналитов, например, кальцитонина, паратгормона, СТГ, инсулина и С-пептида обязательно проводится натощак. Необходимость соблюдения определенной диеты при проведении того или иного вида анализа, оговорена в справочно-методической литературе, а также в инструкциях по применению наборов.
оказывающим влияние на концентрацию большинства аналитов в клинической химии, а также некоторых биологически активных соединений, определяемых иммунохимическими методами. Например, кофеин обладает способностью ингибировать расщепление цАМФ, повышает активность плазматического ренина и концентрацию катехоламинов. Голодание приводит к увеличению содержания в образцах сыворотки (плазмы) крови кортизола и дегидроэпиандростеронсульфата, а бессолевая диета – к повышению уровня альдостерона в 3–5 раз. Для таких случаев разработаны специальные рекомендации по подготовке пациента к отбору образцов крови. Например, определение активности плазматического ренина должно проводиться при стандартном потреблении K+ и Na+, при этом также исключается назначение диуретиков, гипотензивных средств
и β-блокаторов, ограничивается курение и прием напитков, содержащих кофеин. Взятие образцов крови для определения концентрации ряда аналитов, например, кальцитонина, паратгормона, СТГ, инсулина и С-пептида обязательно проводится натощак. Необходимость соблюдения определенной диеты при проведении того или иного вида анализа, оговорена в справочно-методической литературе, а также в инструкциях по применению наборов.
Факторы, связанные с условиями отбора проб
Место отбора образца крови
Вена, артерия или капилляры, определяется процедурными аспектами. Для проведения иммунохимических исследований основным методом отбора крови является венепункция. Для уменьшения внутри- и межиндивидуальной вариации результатов лабораторных исследований необходимым условием является стандартизация процедуры отбора крови (соблюдение фазы отдыха и голодания, положения тела пациента, времени суток, длительности наложения жгута).
Следует иметь в виду, что содержание аналитов в венозной и капиллярной крови может существенно различаться, например, при проведении теста на толерантность к глюкозе.
Следует иметь в виду, что содержание аналитов в венозной и капиллярной крови может существенно различаться, например, при проведении теста на толерантность к глюкозе.
Объем крови
отобранной у пациента, должен быть сведен к разумному минимуму с тем, чтобы избежать таких ее потерь, которые при часто повторяющихся исследованиях могут привести к развитию анемии. Однако количество сыворотки или плазмы, полученной из образца крови, должно превышать необходимый для анализа объем как минимум в 2–3 раза, принимая во внимание возможность проведения повторного или дополнительного исследования, а также резервирование архивных образцов. Если анализ не будет проводиться в тот же день, рекомендуется разделить весь имеющийся анализируемый материал на 2–3 аликвоты подходящего объема, чтобы обеспечить рекомендуемые условия хранения исследуемого образца, исключить повторные циклы замораживания и оттаивания проб, а также сократить вероятность их контаминации при повторных исследованиях.
Периодичность взятия проб
Повторные взятия проб крови широко используются в динамических исследованиях, например, при проведении стимуляционных тестов, для оценки эффективности проводимого лечения, при прогнозировании исхода заболевания, при лекарственном мониторинге, а также в целом ряде других случаев. Интервалы между отбором образцов, помимо конкретных задач исследования, должны определяться с учетом следующих факторов:
• периода биологической полужизни определяемого аналита. Например, для оценки уровня ПСА в постоперационном периоде отбор образцов крови для исследования должен проводиться не ранее, чем через 10–14 дней после хирургического вмешательства;
• фармакокинетических свойств препаратов при проведении
терапевтического лекарственного мониторинга. Например, забор крови
для определения циклоспорина А должен производиться непосредственно перед приемом следующей его дозы, а для сердечных гликозидов – через 4 часа после введения препарата;
• динамики изменения концентрации аналита в ходе нормальных или патологических процессов (мониторинг беременности, диагностика и мониторинг опухолевых и инфекционных заболеваний и др). Обычно при этом индивидуальные колебания уровней исследуемых аналитов могут быть очень значительными (свободный эстриол, ХГЧ, АФП и др.). В этих случаях нормальные диапазоны не являются достаточно информативными для постановки диагноза. Вместо них используют значения медиан нормальных концентраций;
• при мониторинге опухолевых заболеваний, а также для оценки эффективности проводимого лечения в качестве точки отсчета используются индивидуальные базовые уровни онкомаркеров до начала терапии. Последующие заборы образцов крови проводятся через строго определенные клиницистами промежутки времени. Этот же принцип используется при диагностике и лечении инфекционных заболеваний – выявление специфических антител к возбудителю и динамика их уровней в ходе лечения.
• периода биологической полужизни определяемого аналита. Например, для оценки уровня ПСА в постоперационном периоде отбор образцов крови для исследования должен проводиться не ранее, чем через 10–14 дней после хирургического вмешательства;
• фармакокинетических свойств препаратов при проведении
терапевтического лекарственного мониторинга. Например, забор крови
для определения циклоспорина А должен производиться непосредственно перед приемом следующей его дозы, а для сердечных гликозидов – через 4 часа после введения препарата;
• динамики изменения концентрации аналита в ходе нормальных или патологических процессов (мониторинг беременности, диагностика и мониторинг опухолевых и инфекционных заболеваний и др). Обычно при этом индивидуальные колебания уровней исследуемых аналитов могут быть очень значительными (свободный эстриол, ХГЧ, АФП и др.). В этих случаях нормальные диапазоны не являются достаточно информативными для постановки диагноза. Вместо них используют значения медиан нормальных концентраций;
• при мониторинге опухолевых заболеваний, а также для оценки эффективности проводимого лечения в качестве точки отсчета используются индивидуальные базовые уровни онкомаркеров до начала терапии. Последующие заборы образцов крови проводятся через строго определенные клиницистами промежутки времени. Этот же принцип используется при диагностике и лечении инфекционных заболеваний – выявление специфических антител к возбудителю и динамика их уровней в ходе лечения.
Использование антикоагулянтов
является обязательным при проведении некоторых видов анализа (ренин, АКТГ, цАМФ, катехоламины, эндорфин и др.), чтобы предотвратить быстрое разрушение этих нестабильных соединений. Следует иметь в виду, что для ряда аналитов существует диагностически значимая разница между результатами, полученными при биохимическом или иммунологическом исследовании сыворотки и плазмы (нейронспецифическая энолаза, тиреотропный гормон, дофамин, серотонин, некоторые виды антител и др.). Эти различия могут быть обусловлены следующими техническими и физиологическими причинами:
• аналит может участвовать в образовании сгустка;
• аналит может высвобождаться из клеток в процессе свертывания крови;
• присутствие антикоагулянта или фибриногена может влиять на процессы,
протекающие в ходе анализа (интерференция).
Метод-зависимая интерференция является наиболее частой причиной
получения неадекватных результатов при иммунохимических исследованиях.
Поэтому необходимо использовать рекомендуемый тип и концентрацию
антикоагулянта, поскольку, оставаясь в составе анализируемой пробы, он может изменять ее физико-химические свойства и оказывать негативное влияние на протекание иммунохимической реакции, например, подавлять связывающую активность антител или ингибировать ферментативную активность конъюгата. При проведении анализа в цельной крови (циклоспорин) взятые пробы должны быть очень тщательно перемешаны с антикоагулянтом, так как образование микросгустков будет отражаться на полученных результатах.
• аналит может участвовать в образовании сгустка;
• аналит может высвобождаться из клеток в процессе свертывания крови;
• присутствие антикоагулянта или фибриногена может влиять на процессы,
протекающие в ходе анализа (интерференция).
Метод-зависимая интерференция является наиболее частой причиной
получения неадекватных результатов при иммунохимических исследованиях.
Поэтому необходимо использовать рекомендуемый тип и концентрацию
антикоагулянта, поскольку, оставаясь в составе анализируемой пробы, он может изменять ее физико-химические свойства и оказывать негативное влияние на протекание иммунохимической реакции, например, подавлять связывающую активность антител или ингибировать ферментативную активность конъюгата. При проведении анализа в цельной крови (циклоспорин) взятые пробы должны быть очень тщательно перемешаны с антикоагулянтом, так как образование микросгустков будет отражаться на полученных результатах.
Температурные условия
забора и последующей обработки крови очень важны при определении таких нестабильных соединений, как АКТГ, ренин, катехоламины, цАМФ, С-пептид, инсулин, проинсулин, гастрин, пепсиноген, глюкагон, соматостатин и др. Сразу же после отбора проб пробирки с кровью должны быть помещены в контейнер со льдом. Все дальнейшие процедуры – центрифугирование, отбор cыворотки и ее аликвотирование, должны проводиться быстро и при температуре, не превышающей +4°С. Полученные образцы сыворотки крови, если они сразу же не используются для анализа, должны быть немедленно заморожены. Несоблюдение этих условий может серьезно и необратимо исказить результаты исследования. Использование ингибитора протеиназы – апротинина (трасилола) в смеси с антикоагулянтом рекомендовано для стабилизации ферментов и гормонов белковой природы.
Гемолиз и липемия проб
являются факторами риска, способными снижать достоверность результатов анализа. Это связано с тем, что в клетках крови содержится в высокой концентрации целый ряд компонентов, определяемых
в сыворотке или плазме. При гемолизе они могут высвобождаться в анализируемую пробу и изменять ее состав, затрудняя интерпретацию результатов исследования. Мутные образцы с повышенным содержанием липопротеинов и триглицеридов не рекомендуется использовать в качестве анализируемого материала для определения стероидов и других липофильных компонентов из-за снижения доступности определяемого вещества для специфических антител. Влияние гемолиза и липемии на результаты исследований представляет собой метод-зависимую интерференцию, поэтому лаборатории должны обращать самое пристальное внимание на соответствующие сведения, приведенные в инструкциях по применению наборов, а также в методической литературе. Кроме того, стандартизация преаналитического этапа (использование стандартных игл, закрытых пробирок, калиброванных центрифуг, соблюдение рекомендованных температурных и временных режимов обработки проб и т.д.) позволит значительно снизить риск получения некачественного аналитического материала. Из специальных рекомендаций следует отметить, что при заборе крови для определения АКТГ рекомендуется использовать пробирки из полистирола, т.к. стекло адсорбирует этот гормон. При определении ß2-микроглобулина в моче следует учитывать рН образца,
т.к. данный белок быстро разрушается в щелочной среде.
в сыворотке или плазме. При гемолизе они могут высвобождаться в анализируемую пробу и изменять ее состав, затрудняя интерпретацию результатов исследования. Мутные образцы с повышенным содержанием липопротеинов и триглицеридов не рекомендуется использовать в качестве анализируемого материала для определения стероидов и других липофильных компонентов из-за снижения доступности определяемого вещества для специфических антител. Влияние гемолиза и липемии на результаты исследований представляет собой метод-зависимую интерференцию, поэтому лаборатории должны обращать самое пристальное внимание на соответствующие сведения, приведенные в инструкциях по применению наборов, а также в методической литературе. Кроме того, стандартизация преаналитического этапа (использование стандартных игл, закрытых пробирок, калиброванных центрифуг, соблюдение рекомендованных температурных и временных режимов обработки проб и т.д.) позволит значительно снизить риск получения некачественного аналитического материала. Из специальных рекомендаций следует отметить, что при заборе крови для определения АКТГ рекомендуется использовать пробирки из полистирола, т.к. стекло адсорбирует этот гормон. При определении ß2-микроглобулина в моче следует учитывать рН образца,
т.к. данный белок быстро разрушается в щелочной среде.
Идентификация проб
Подготовленный и промаркированный биологический материал должен быть как можно быстрее доставлен в лабораторию. Следует иметь в виду, что упущения при транспортировке, нарушающие сохранность проб, делают невозможным правильное определение концентрации аналита. Для пересылки проб следует использовать герметически закрывающиеся пробирки из инертного небьющегося материала. Пробирки должны быть помещены в специальный контейнер с абсорбентом, который снижает риск протекания при каком-либо механическом повреждении и обеспечивает необходимые меры безопасности для людей и окружающей среды. При транспортировке охлажденных или замороженных образцов рекомендуется использовать теплоизолирующий контейнер из пенопласта, в который можно поместить сухой лед или охлаждающие элементы. Особого температурного режима (+4 °С) требует пересылка проб, предназначенных для определения таких лабильных аналитов, как АКТГ, инсулин, С-пептид, ренин, СТГ, альдостерон. В некоторых случаях для анализа используются пробы сухих пятен крови на фильтровальной бумаге (циклоспорин, неонатальный ТТГ). Пересылка таких образцов может осуществляться по почте без соблюдения особых температурных условий. Единственным требованием является надежная упаковка проб, с тем, чтобы обеспечить их сохранность в процессе доставки, а также исключить контакт с потенциально инфекционным материалом.
Транспортировка проб в лабораторию
Подготовленный и промаркированный биологический материал должен быть как можно быстрее доставлен в лабораторию. Следует иметь в виду, что упущения при транспортировке, нарушающие сохранность проб, делают невозможным правильное определение концентрации аналита. Для пересылки проб следует использовать герметически закрывающиеся пробирки из инертного небьющегося материала. Пробирки должны быть помещены в специальный контейнер с абсорбентом, который снижает риск протекания при каком-либо механическом повреждении и обеспечивает необходимые меры безопасности для людей и окружающей среды. При транспортировке охлажденных или замороженных образцов рекомендуется использовать теплоизолирующий контейнер из пенопласта, в который можно поместить сухой лед или охлаждающие элементы. Особого температурного режима (+4 °С) требует пересылка проб, предназначенных для определения таких лабильных аналитов, как АКТГ, инсулин, С-пептид, ренин, СТГ, альдостерон. В некоторых случаях для анализа используются пробы сухих пятен крови на фильтровальной бумаге (циклоспорин, неонатальный ТТГ). Пересылка таких образцов может осуществляться по почте без соблюдения особых температурных условий. Единственным требованием является надежная упаковка проб, с тем, чтобы обеспечить их сохранность в процессе доставки, а также исключить контакт с потенциально инфекционным материалом.
Первичная обработка проб
Желательно, чтобы пробы цельной крови были доставлены в лабораторию не позднее, чем через 45 минут после отбора, а их обработка [центрифугирование, отделение сыворотки (плазмы) от осадка и ее аликвотирование] должна быть завершена в течение 1 часа после забора крови. Это необходимо для обеспечения сохранности тех аналитов, которые быстро разрушаются даже при +4°С, особенно, если сыворотка не отделена от сгустка крови (С-пептид). Обработанные образцы сыворотки (плазмы) крови должны сразу же использоваться для проведения анализа. В противном случае их нужно заморозить при температуре -20 °С. В таком виде их можно хранить в течение некоторого времени, оговоренного в инструкции к набору реагентов.
Таким образом, контролируемыми параметрами преаналитического этапа являются подготовка пациента, отбор анализируемого материала, идентификация проб и их первичная обработка, использование консервантов, а также транспортировка и хранение исследуемых образцов до проведения анализа. Персонал лаборатории должен хорошо представлять себе требования к долабораторному этапу и тщательно их соблюдать. Это должно являться правилом при проведении любых видов анализа, как биохимического, так и иммунохимического.
Таким образом, контролируемыми параметрами преаналитического этапа являются подготовка пациента, отбор анализируемого материала, идентификация проб и их первичная обработка, использование консервантов, а также транспортировка и хранение исследуемых образцов до проведения анализа. Персонал лаборатории должен хорошо представлять себе требования к долабораторному этапу и тщательно их соблюдать. Это должно являться правилом при проведении любых видов анализа, как биохимического, так и иммунохимического.
Аналитический этап
Основные причины появления погрешностей на данном этапе могут носить как объективный, биологический, так и субъективный характер, связанный с допущением лабораторных ошибок.
Плохая организация работы в лаборатории
является фактором, приводящим к увеличению числа случайных ошибок, допускаемых персоналом при проведении анализа (неправильный отбор проб, ошибочное внесение компонентов не в те лунки, пролив реагентов и их загрязнение, несоблюдение рекомендуемых временных интервалов и т.п. и условий хранения исследуемых образцов и наборов реагентов).
Лабораторное помещение должно соответствовать требованиям, изложенным
в соответствующих ведомственных инструкциях, а также быть приспособленным для проведения лабораторного микроанализа. Последнее подразумевает, в том числе, отсутствие общей загроможденности, наличие достаточного количества места для проведения анализа, а также оптимальное расположение приборов и лабораторного оборудования.
Специфическим и очень важным требованием для проведения
иммуноферментного, а также любого иммунохимического анализа, является
оптимальная температура в помещении (+18…+25 °С). Следствием работы при более низкой (высокой) температуре может быть значительное изменение регистрируемой оптической плотности растворов в лунках, ухудшение чувствительности метода, сокращение диапазона определяемых концентраций и, как следствие, получение искаженных результатов анализа.
Существует несколько механизмов изменения аналитических характеристик
наборов реагентов в зависимости от температуры, при которой проводится
эксперимент: нарушение иммунохимического равновесия, изменение скорости развития окраски, подсыхание растворов и образование солево-белкового «ободка» на внутренней поверхности лунок планшета при высокой температуре и низкой влажности воздуха в помещении и др. Попытки скорректировать влияние температуры на результаты анализа путем изменения времени инкубации далеко не всегда бывают успешными, особенно если состав калибровочных проб, контрольной сыворотки и исследуемых образцов имеет значительные различия. Поэтому единственно правильным решением будет проведение инкубации в термостате, установленном на комнатную температуру (+18…+25 °С), если в помещении холодно, и отмена анализа – если слишком жарко. Категорически запрещается инкубировать планшеты вблизи нагревательных приборов, так как при этом температура в разных лунках будет различной, а изменения результатов анализа станут непредсказуемыми.
Наличие хорошей вытяжной вентиляции является важным условием при
работе с иммуноферментными наборами, так как в их состав входят вещества
(ОФД, ТМБ, растворы кислот, ртутьсодержащие консерванты, антибиотики, а также аэрозоли используемых реагентов), представляющие определенную опасность для лабораторного персонала. Кроме того, в некоторых методиках присутствуют стадии экстракции анализируемого вещества органическими растворителями.
Лабораторное помещение должно соответствовать требованиям, изложенным
в соответствующих ведомственных инструкциях, а также быть приспособленным для проведения лабораторного микроанализа. Последнее подразумевает, в том числе, отсутствие общей загроможденности, наличие достаточного количества места для проведения анализа, а также оптимальное расположение приборов и лабораторного оборудования.
Специфическим и очень важным требованием для проведения
иммуноферментного, а также любого иммунохимического анализа, является
оптимальная температура в помещении (+18…+25 °С). Следствием работы при более низкой (высокой) температуре может быть значительное изменение регистрируемой оптической плотности растворов в лунках, ухудшение чувствительности метода, сокращение диапазона определяемых концентраций и, как следствие, получение искаженных результатов анализа.
Существует несколько механизмов изменения аналитических характеристик
наборов реагентов в зависимости от температуры, при которой проводится
эксперимент: нарушение иммунохимического равновесия, изменение скорости развития окраски, подсыхание растворов и образование солево-белкового «ободка» на внутренней поверхности лунок планшета при высокой температуре и низкой влажности воздуха в помещении и др. Попытки скорректировать влияние температуры на результаты анализа путем изменения времени инкубации далеко не всегда бывают успешными, особенно если состав калибровочных проб, контрольной сыворотки и исследуемых образцов имеет значительные различия. Поэтому единственно правильным решением будет проведение инкубации в термостате, установленном на комнатную температуру (+18…+25 °С), если в помещении холодно, и отмена анализа – если слишком жарко. Категорически запрещается инкубировать планшеты вблизи нагревательных приборов, так как при этом температура в разных лунках будет различной, а изменения результатов анализа станут непредсказуемыми.
Наличие хорошей вытяжной вентиляции является важным условием при
работе с иммуноферментными наборами, так как в их состав входят вещества
(ОФД, ТМБ, растворы кислот, ртутьсодержащие консерванты, антибиотики, а также аэрозоли используемых реагентов), представляющие определенную опасность для лабораторного персонала. Кроме того, в некоторых методиках присутствуют стадии экстракции анализируемого вещества органическими растворителями.
Ошибки, связанные с лабораторным оборудованием
При использовании нестандартизованного лабораторного оборудования, а именно, дозирующих устройств, термостатов, спектрофотометров, могут появляться ошибки, имеющие систематический или случайный характер.
Дозаторы
Неправильное дозирование растворов при проведении микроанализа критическим образом сказывается на полученных результатах.
Поэтому не реже одного раза в месяц (лучше еженедельно) необходимо проводить проверку работы дозаторов на точность и сходимость результатов пипетирования, например, весовым методом. Допустимая погрешность пипеток не должна превышать 5%.
Поэтому не реже одного раза в месяц (лучше еженедельно) необходимо проводить проверку работы дозаторов на точность и сходимость результатов пипетирования, например, весовым методом. Допустимая погрешность пипеток не должна превышать 5%.
Промывающее устройство планшет
Распространенным источником получения ошибочных результатов является плохая работа промывающего устройства, которая заключается в неравномерном заполнении лунок отмывочным раствором и/или его неполном удалении.
Наиболее частой причиной нарушения работы автоматического или ручного
промывающего устройства является засорение одного из его каналов кристаллами солей буферного раствора, или другими крупными взвешенными частицами. Возникающая при этом недостаточная промывка, т.е. неполное удаление непрореагировавших компонентов (особенно конъюгата) приводит к увеличению сигнала в определенном ряду лунок (или в одной и той же лунке при использовании 96-канального промывателя) на разных планшетах. Несмотря на кажущуюся простоту выявления такой ошибки, необходимо исключить возможность появления аналогичной картины, связанной с неисправностью промывающего устройство. Иногда нарушается подача/аспирация растворов из-за засорения внутреннего канала промывающего устройства между иглами. Это приводит к частичному переносу реагентов из одной лунки в другую. При этом в лунках, соседних по ряду с сильноокрашенными образцами, также будет наблюдаться повышенная оптическая плотность, снижающаяся по мере удаления от исходной лунки. Желательно, чтобы в процессе промывки лунки полностью заполнялись раствором. Это способствует более полному удалению следов сыворотки и конъюгата с их внутренних боковых поверхностей. Засорение входного фильтра, пророст в шлангах и другие причины, препятствующие свободному передвижению жидкости, также приводят к сбоям в работе промывающих устройств. Поэтому необходимо ежедневно визуально контролировать качество (однородность) заполнения лунок и удаления растворов. В конце рабочего дня необходимо тщательно промыть устройство дистиллированной водой. Это предотвратит кристаллизацию солей в каналах промывателя и снизит вероятность пророста в подающих и выпускных шлангах.
Наиболее частой причиной нарушения работы автоматического или ручного
промывающего устройства является засорение одного из его каналов кристаллами солей буферного раствора, или другими крупными взвешенными частицами. Возникающая при этом недостаточная промывка, т.е. неполное удаление непрореагировавших компонентов (особенно конъюгата) приводит к увеличению сигнала в определенном ряду лунок (или в одной и той же лунке при использовании 96-канального промывателя) на разных планшетах. Несмотря на кажущуюся простоту выявления такой ошибки, необходимо исключить возможность появления аналогичной картины, связанной с неисправностью промывающего устройство. Иногда нарушается подача/аспирация растворов из-за засорения внутреннего канала промывающего устройства между иглами. Это приводит к частичному переносу реагентов из одной лунки в другую. При этом в лунках, соседних по ряду с сильноокрашенными образцами, также будет наблюдаться повышенная оптическая плотность, снижающаяся по мере удаления от исходной лунки. Желательно, чтобы в процессе промывки лунки полностью заполнялись раствором. Это способствует более полному удалению следов сыворотки и конъюгата с их внутренних боковых поверхностей. Засорение входного фильтра, пророст в шлангах и другие причины, препятствующие свободному передвижению жидкости, также приводят к сбоям в работе промывающих устройств. Поэтому необходимо ежедневно визуально контролировать качество (однородность) заполнения лунок и удаления растворов. В конце рабочего дня необходимо тщательно промыть устройство дистиллированной водой. Это предотвратит кристаллизацию солей в каналах промывателя и снизит вероятность пророста в подающих и выпускных шлангах.
Спектрофотометр
Одной из распространенных причин получения неправильных результатов является измерение оптической плотности без достаточного предварительного прогрева прибора. При этом его погрешность будет значительно превышать допустимую. Ввиду конструктивных особенностей некоторых спектрофотометров точность измерения может заметно снижаться при оптической плотности свыше 2,5–3,0 о.е.
Качество работы спектрофотометра можно оценить путем повторного измерения оптической плотности лунок в одном и том же планшете. При проведении повторного измерения желательно развернуть планшет на 180°. Допустимым является отклонение результатов измерения оптической плотности в одной и той же лунке, не превышающее 2%. Следует иметь в виду, что изменение оптической плотности содержимого
лунок может быть вызвано наличием капель, царапин, отпечатков пальцев и других загрязнений на дне лунок. Поэтому перед проведением регистрации результатов их следует аккуратно протереть мягкой сухой безворсовой салфеткой. Для получения адекватных результатов следует использовать только тот светофильтр, который обеспечивает необходимую длину волны считывания, так как ее изменение приводит к резкому снижению регистрируемой оптической плотности. Ошибка легко выявляется при визуальной оценке результатов и их сравнении с распечаткой оптической плотности лунок.
Качество работы спектрофотометра можно оценить путем повторного измерения оптической плотности лунок в одном и том же планшете. При проведении повторного измерения желательно развернуть планшет на 180°. Допустимым является отклонение результатов измерения оптической плотности в одной и той же лунке, не превышающее 2%. Следует иметь в виду, что изменение оптической плотности содержимого
лунок может быть вызвано наличием капель, царапин, отпечатков пальцев и других загрязнений на дне лунок. Поэтому перед проведением регистрации результатов их следует аккуратно протереть мягкой сухой безворсовой салфеткой. Для получения адекватных результатов следует использовать только тот светофильтр, который обеспечивает необходимую длину волны считывания, так как ее изменение приводит к резкому снижению регистрируемой оптической плотности. Ошибка легко выявляется при визуальной оценке результатов и их сравнении с распечаткой оптической плотности лунок.
Термостат
При использовании термостата необходимо контролировать температуру на верхней и нижней его полке с помощью дополнительного контрольного термометра. Для исключения подсыхания лунок во время длительной инкубации рекомендуется использовать влажную камеру, или заклеивать лунки специальной бумагой для заклеивания планшет, входящей в комплект набора реагентов.
Прибор для встряхивания планшет (шейкер)
необходим в тех случаях, когда, согласно протоколу анализа, одна или несколько его стадий должны проводиться при постоянном встряхивании. Соблюдение рекомендуемой частоты кругового перемешивания растворов в лунках обеспечивает оптимальные условия протекания иммунохимической реакции и способствует получению воспроизводимых результатов. При слишком интенсивном встряхивании может происходить десорбция иммобилизованных на планшете реагентов, а также выплескивание растворов из лунок. При недостаточном перемешивании,
а также при инкубации без встряхивания будет наблюдаться заметное снижение оптической плотности, а в некоторых случаях возможно получение ложных результатов. Следует иметь в виду, что продление времени инкубации далеко не всегда может компенсировать отсутствие встряхивания.
а также при инкубации без встряхивания будет наблюдаться заметное снижение оптической плотности, а в некоторых случаях возможно получение ложных результатов. Следует иметь в виду, что продление времени инкубации далеко не всегда может компенсировать отсутствие встряхивания.
Автоматический анализатор
В крупных лабораториях, выполняющих значительное количество исследований, часто используются автоматические ИФА-анализаторы, которые позволяют значительно сократить трудозатраты на исполнение анализа. В состав таких автоматов входят узлы, обеспечивающие проведение всех стадий анализа, т.е. предварительное разведение исследуемых образцов, внесение реагентов, инкубацию, отмывку и спектрофотометрию лунок. Появление систематических проблем при автоматизированном проведении того или иного вида анализа и исчезающих при ручном его исполнении, может быть связано со сбоями в работе одного из узлов анализатора (дозирующего устройства, блоков отмывки лунок и встряхивания планшет, спектрофотометра или термостата).
Такие погрешности, относящиеся к разряду технических, достаточно легко выявить и устранить. Однако существует другая причина систематического получения ошибочных результатов. Некоторые виды анализаторов из-за своих конструктивных особенностей не способны обеспечить одинаковую продолжительность инкубации для всех лунок планшета. Иногда разница во времени внесения компонентов в первую и последнюю лунку может достигать 18 минут, что неизбежно приведет к дрейфу полученных результатов и будет особенно заметно в анализах, протоколы
которых предусматривают короткую инкубацию. Наличие дрейфа можно
выявить с помощью контрольной пробы, которую вносят в первую после лунок с калибровочными пробами, в центральную и в последнюю лунку используемого планшета.
Такие погрешности, относящиеся к разряду технических, достаточно легко выявить и устранить. Однако существует другая причина систематического получения ошибочных результатов. Некоторые виды анализаторов из-за своих конструктивных особенностей не способны обеспечить одинаковую продолжительность инкубации для всех лунок планшета. Иногда разница во времени внесения компонентов в первую и последнюю лунку может достигать 18 минут, что неизбежно приведет к дрейфу полученных результатов и будет особенно заметно в анализах, протоколы
которых предусматривают короткую инкубацию. Наличие дрейфа можно
выявить с помощью контрольной пробы, которую вносят в первую после лунок с калибровочными пробами, в центральную и в последнюю лунку используемого планшета.
