Сложности и проблемы проточной цитометрии
Надежда Попова
Проточная цитометрия (ПЦ) оказалась чрезвычайно универсальным и полезным инструментом для диагностики и мониторинга иммунологических, гематологических заболеваний в дополнение ко многим другим применениям. Значительные достижения в области электроники, программного обеспечения и реагентов за последние годы упростили некоторые аспекты ПЦ, в то же время способность комбинировать 8–10 антител в одной пробирке может создать как технические, так и интерпретационные проблемы, которые труднее обнаружить при использовании только 3–4 цветовых комбинаций. Использование многопараметрических панелей может облегчить идентификацию аномальных популяций. Однако характеристики опухолевого населения могут создавать потенциальные диагностические ошибки. Понимание нормальных иммунофенотипических паттернов в состоянии покоя, восстановления, и активация является критическим первым шагом для того, чтобы надлежащим образом идентифицировать аномальные популяции, которые характеризуют гематопоэтические новообразования. Кроме того, внедрение новых терапевтических стратегий, в частности таргетной терапии, может изменять стандартные методы анализа данных проточной цитометрии, и знание влияния терапии на данные проточной цитометрии имеет решающее значение для точной интерпретации данных.
Сложности при работе на ПЦ?
Различные составляющие образца:
особенности транспортировки, хранения, приготовления образца, обработки патогенов.
Сложные технологии:
обеспечение адекватных условий окружающей среды, спецификация и обслуживание прибора.
Множество пользователей:
обучение персонала, подготовка к работе на инструменте, документирование всех процедур.
Нормативы для лабораторий помогают структурировать работу на ПЦ и обеспечить правильность исследований.
Фундаментальные исследования: MIFlowCyt
GLP Good Laboratory Practice – свод международных требований к лабораторным исследованиям (законодательно регулируемо)
Анализ последующего использования в цикле разработки лекарственных средств для мониторинга пациентов в клинических испытаниях и т.д.: схожие с GLP условия
Анализ в виде контроля качества фармацевтической продукции: GMP Good Manufacturing Practice – свод международных требований к производству
Медицинские диагностические лаборатории: Директивы Ассоциации Медицинских Работников, Аккредитация
Общие требования
- Персонал: экспертиза, авторизация;
- Помещения: доступ, условия окружающей среды
- Оборудование: обслуживание, отчеты
- Реагенты, логистика
- Валидированные процедуры
- Внутренний и внешний контроль качества
- Референсные значения
- Соответствующая интерпретация
Факторы, влияющие на анализы
1
Подготовка
• Фиколл или лизис
• С промывкой / без промывки
• Антикоагулянты
• С промывкой / без промывки
• Антикоагулянты
2
Флуорохромы
• 2,3,4…32 цвета
• Коньюгаты
• Контроли
• Компенсация
• Коньюгаты
• Контроли
• Компенсация
3
Гейтирование
• Иммунологическое гейтирование
• Опознание живая/неживая клетка
• Дискриминация дуплетов
• Опознание живая/неживая клетка
• Дискриминация дуплетов
4
Абсолютный подсчет (клетки/мкл)
• Одноплатформенный или двуплатформенный цитометр
• Спецификации (лазер, фильтры…)
• Контроль лазеров и проточной системы
• Спецификации (лазер, фильтры…)
• Контроль лазеров и проточной системы
5
Нормативные директивы
• GLP, аккредитация
• Планы исследования
• Правила компенсации
• Планы исследования
• Правила компенсации
Из применяемых антикоагулянтов аммоний-гепарин наиболее стабилен (48 ч), ЭДТА более удобен, но должен быть использован в течение 12 часов. Цитрат воздействует на поверхностные маркеры, вызывая лизис, а хлорид аммония нестабилен.
Различные реагенты для лизирования приводят к различиям в характеристиках рассеяния клеток. Лизис с фиксацией наиболее стабилен.
Цитометр анализирует частицы, но не может различать единичные события от дуплетов или агрегатов. Это приводит к ошибочным результатам, особенно когда анализируется ДНК или редкие события.
Агрегаты клеток значительно снижают точность анализа. Применение клеточных фильтров (40 мкм) предотвращают засорение. Кроме этого рекомендуют добавление ДНК-азы или коллагеназы/диспазы. Многие образцы содержат клеточные дублеты. Они могут присутствовать в значительных количествах в недостаточно дезагрегированных образцах ткани и в некоторых В-клеточных злокачественных опухолях, а также когда используются более высокие скорости потока. Проточный цитометр может обнаруживать дублеты на основе различий в рассеивании света, где дублеты могут иметь ту же общую флуоресценцию, что и большая клетка, но амплитуда сигнала будет отличаться между ними, как и время движения (TOF). Посредством построения графика прямой рассеяния в зависимости от прямой амплитуды (высоты) или TOF довольно легко обнаружить и исключить дублеты из анализа. Дублеты могут создавать картину аномальной популяции клеток.
Цитометр анализирует частицы, но не может различать единичные события от дуплетов или агрегатов. Это приводит к ошибочным результатам, особенно когда анализируется ДНК или редкие события.
Агрегаты клеток значительно снижают точность анализа. Применение клеточных фильтров (40 мкм) предотвращают засорение. Кроме этого рекомендуют добавление ДНК-азы или коллагеназы/диспазы. Многие образцы содержат клеточные дублеты. Они могут присутствовать в значительных количествах в недостаточно дезагрегированных образцах ткани и в некоторых В-клеточных злокачественных опухолях, а также когда используются более высокие скорости потока. Проточный цитометр может обнаруживать дублеты на основе различий в рассеивании света, где дублеты могут иметь ту же общую флуоресценцию, что и большая клетка, но амплитуда сигнала будет отличаться между ними, как и время движения (TOF). Посредством построения графика прямой рассеяния в зависимости от прямой амплитуды (высоты) или TOF довольно легко обнаружить и исключить дублеты из анализа. Дублеты могут создавать картину аномальной популяции клеток.
На рисунке 1:
(а) Показан пример, в котором дублеты могут создавать аномальную популяцию, экспрессирующую как CD19, так и CD5 (окрашены в черный цвет).
(b) После удаления дублета явно существует CD5-положительная популяция (синяя) и CD19-положительная (красная), которые разделены, но популяция дублетов, демонстрирующая явную экспрессию CD5 и CD19 (вероятно, дублетов В-клеток и Т ячеек) больше нет
(а) Показан пример, в котором дублеты могут создавать аномальную популяцию, экспрессирующую как CD19, так и CD5 (окрашены в черный цвет).
(b) После удаления дублета явно существует CD5-положительная популяция (синяя) и CD19-положительная (красная), которые разделены, но популяция дублетов, демонстрирующая явную экспрессию CD5 и CD19 (вероятно, дублетов В-клеток и Т ячеек) больше нет
При работе с образцами с очень небольшим количеством клеток, например, спинномозговой жидкостью, или при выполнении минимального остаточного обнаружения опухолевых клеток, важно, чтобы прибор был чистым (например, чистящая панель или пустая пробирка должна быть запущена до образца), чтобы не было переноса клеток из предыдущего образца.
Наконец, когда пробы запускаются на проточном цитометре, обычной практикой является использование заранее определенных протоколов с предварительно выбранными комбинациями антител, чтобы упростить анализ как во время, так и в автономном режиме после сбора данных. Если выбранный протокол не соответствует применяемым комбинациям антител и флуорохрома, существует вероятность неправильной характеристики популяции клеток. Всегда проверка образцов окрашивания остаточных нормальных популяций является одним из способов обнаружить это.
Несоблюдение протокола отмывки приводит к неправильным результатам.
Несоблюдение протокола отмывки приводит к неправильным результатам.
На рисунке 2:
Неправильная отмывка. На всех графиках показаны все CD19-позитивные клетки из образца костного мозга. Улучшение связывания сигнала с шумом антител легкой цепи с увеличением предварительной промывки образца. Промывку осуществляли с 0,3% альбумина в забуференном солевом растворе. Количество отмывок увеличивается слева направо до окрашивания; (а) без отмывки; (б) одна отмывка; (в) две отмывки; (г) три отмывки; и (д) три отмывки и 10 минут блокирования с 5% альбумина.
Неправильная отмывка. На всех графиках показаны все CD19-позитивные клетки из образца костного мозга. Улучшение связывания сигнала с шумом антител легкой цепи с увеличением предварительной промывки образца. Промывку осуществляли с 0,3% альбумина в забуференном солевом растворе. Количество отмывок увеличивается слева направо до окрашивания; (а) без отмывки; (б) одна отмывка; (в) две отмывки; (г) три отмывки; и (д) три отмывки и 10 минут блокирования с 5% альбумина.
Некоторые образцы могут демонстрировать устойчивость к лизису эритроцитов в зависимости от заболевания пациентов или применяемой лекарственной терапии. Нагревание образца во время инкубации в лизирующем агенте, его встряхивание может увеличить лизис эритроцитов. Традиционно антитела сначала добавляют в окрашивающую пробирку, а затем образец помещают в пробирку. Если это не сделать осторожно, то часть образца плохо смешивается с антителом. В таких случаях клетки могут иметь два уровня окрашивания, один с адекватной экспрессией, а второй с уменьшенной. Например, при тестировании клеток с дефицитом гликозилфосфатидилинозитола (GPI) при пароксизмальной ночной гемоглобинурии это может привести к тому, что популяция будет ошибочно классифицирована как содержащая дефицитные по GPI клетки, когда на самом деле клетки нормальные.
Среди возникающих проблем может быть слабый лизис эритроцитов, а также неполное окрашивание образца. При неполном окрашивании клетки могут иметь два уровня экспрессии одного и того же СD. При повторении образца более тусклая популяция CD исчезает, так как является результатом неполного окрашивания.
Среди возникающих проблем может быть слабый лизис эритроцитов, а также неполное окрашивание образца. При неполном окрашивании клетки могут иметь два уровня экспрессии одного и того же СD. При повторении образца более тусклая популяция CD исчезает, так как является результатом неполного окрашивания.
На рисунке 3:
Неполное окрашивание. В этом примере показано влияние неполного окрашивания образца и его влияние на интерпретацию.
(а) Клетки имеют два уровня экспрессии CD59, но снижают экспрессию CD235a.
(b) Повторение того же образца, показывающее, что тусклая популяция CD59 больше не присутствует и является результатом неполного окрашивания.
Неполное окрашивание. В этом примере показано влияние неполного окрашивания образца и его влияние на интерпретацию.
(а) Клетки имеют два уровня экспрессии CD59, но снижают экспрессию CD235a.
(b) Повторение того же образца, показывающее, что тусклая популяция CD59 больше не присутствует и является результатом неполного окрашивания.
Еще одной проблемной областью является проблема расщепления комплексов антитела-красители.
Это может происходить с некоторыми тандемными красителями, например, APC-Alexa 750 или PE-Cyanine 5.5.
Это может происходить с некоторыми тандемными красителями, например, APC-Alexa 750 или PE-Cyanine 5.5.
Когда это происходит, продукт возвращается к исходному флуорохрому, то есть аллофикоцианину (APC) или фикоэритрину (PE). Это имеет эффект отрицательного поверхностного маркера в канале PE или APC, который выглядит положительным, как показано на рисунке 4 . На левой панели показан результат с расщеплением антител от APC-Alexa 750 к APC, при этом воздействие CD2-позитивных Т-клеток ложно представляется положительным для CD34. На правой панели показан этот образец, содержащий новую партию антител.
Всякий раз, когда отмечается неожиданное окрашивание популяции, необходимо переделать анализ с новой партией антител. Защита антител от прямого света, хранение в темных бутылках и извлечение их из холодильника в течение минимального времени, необходимого для подготовки образца, ограничит это разрушение.
Всякий раз, когда отмечается неожиданное окрашивание популяции, необходимо переделать анализ с новой партией антител. Защита антител от прямого света, хранение в темных бутылках и извлечение их из холодильника в течение минимального времени, необходимого для подготовки образца, ограничит это разрушение.
Когда антитела поставляются в предварительно смешанном коктейле, который был проверен, мало вероятно, что неправильное антитело могло быть добавлено в окрашивающую пробирку. Однако если антитела добавляются по отдельности, всегда существует вероятность того, что будет добавлено неправильное антитело или флуорохром. Это трудно обнаружить, особенно в многоцветных многослойных ситуациях, однако всегда следует рассматривать эту возможность. Проверка окрашивания всех популяций в выборке часто позволяет обнаружить эту проблему. Неправильное антитело- флуорохром используется в настройке, вызывает ложноположительный сигнал в одном из каналов, потому что величины компенсации отличаются.
Рисунок 5 показывает пример, где правильное антитело (CD5), но неправильный флуорохром (PE-Cy5) было добавлено к образцу, что привело к ложной CD34-позитивной экспрессии на лимфоцитах. Ложная экспрессия CD34, наблюдаемое в этом примере, связано с тем, что между PE-Cy5 и APC требуется существенная коррекция перелива, которая не требовалась при использовании предполагаемого флуорохрома.
Рисунок 5 показывает пример, где правильное антитело (CD5), но неправильный флуорохром (PE-Cy5) было добавлено к образцу, что привело к ложной CD34-позитивной экспрессии на лимфоцитах. Ложная экспрессия CD34, наблюдаемое в этом примере, связано с тем, что между PE-Cy5 и APC требуется существенная коррекция перелива, которая не требовалась при использовании предполагаемого флуорохрома.
На рисунке 5:
Неправильное антитело флуорохром используется в настройке. На этом рисунке показана панель с CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD34 и CD45.
(а) На всех графиках показаны яркие лимфоциты с низким боковым рассеиванием (SSC) CD45.
(б) Присутствующие клетки являются преимущественно CD3-позитивными клетками (окрашены в синий цвет).
(c) CD3-позитивные Т-клетки кажутся зрелыми и большинство экспрессируют либо CD4, либо CD8.
(d) CD5 PC5.5 был показан в протоколе, используемом на приборе, но фактическим реагентом, использованным в панели, был CD5 PC5.
(е) Синие CD3-позитивные клетки, по-видимому, коэкспрессируют CD2 и CD34.
(f) Синие CD3-позитивные клетки также, по-видимому, коэкспрессируют CD7 и CD34. Эти данные не имеют смысла, так как зрелые Т-клетки должны быть CD34-отрицательными. Использование антитела PC5 на панели вызывает ложноположительный сигнал в канале APC, который в данном случае является CD34 APC. Этот сигнал присутствует, потому что величина компенсации, необходимая для PE-Cy5, намного выше, чем требуется для PE-Cy5.5. Это под компенсацией антитела приводит к ложноположительному сигналу, наблюдаемому в APC.
Неправильное антитело флуорохром используется в настройке. На этом рисунке показана панель с CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD34 и CD45.
(а) На всех графиках показаны яркие лимфоциты с низким боковым рассеиванием (SSC) CD45.
(б) Присутствующие клетки являются преимущественно CD3-позитивными клетками (окрашены в синий цвет).
(c) CD3-позитивные Т-клетки кажутся зрелыми и большинство экспрессируют либо CD4, либо CD8.
(d) CD5 PC5.5 был показан в протоколе, используемом на приборе, но фактическим реагентом, использованным в панели, был CD5 PC5.
(е) Синие CD3-позитивные клетки, по-видимому, коэкспрессируют CD2 и CD34.
(f) Синие CD3-позитивные клетки также, по-видимому, коэкспрессируют CD7 и CD34. Эти данные не имеют смысла, так как зрелые Т-клетки должны быть CD34-отрицательными. Использование антитела PC5 на панели вызывает ложноположительный сигнал в канале APC, который в данном случае является CD34 APC. Этот сигнал присутствует, потому что величина компенсации, необходимая для PE-Cy5, намного выше, чем требуется для PE-Cy5.5. Это под компенсацией антитела приводит к ложноположительному сигналу, наблюдаемому в APC.
Абсолютный подсчет (клетки/ мкл) возможен только с неотмытыми образцами
«Единая платформа»
«золотой стандарт», подсчет частиц известной концентрации, добавленных в ту же пробирку в качестве референсных частиц
«Двойная платформа»
абсолютный подсчет клеток проводится по результатам цитометрических и гематологических данных. Недостаток: два источника ошибок!
Референсные значения
могут зависеть от возраста, от пробоподготовки (например реагенты для лизирования), от суточных ритмов. Известно, что работа иммунитета меняется в течение суток, «суточные часы» в макрофагах контролируют воспалительный иммунный ответ. Референсные значения должны быть валидированы для каждого инструмента, для каждой лаборатории.
Иммунологическое гейтирование, например CD45 от SSC, часто позволяет лучше дискриминировать популяции, чем гейтирование по рассеянию.
Необходимой процедурой является исследование жизнеспособности клеток. Погибшие клетки неспецифично связывают антитела и, следовательно, могут приводить к ложно-положительным результатам.
Иммунологическое гейтирование, например CD45 от SSC, часто позволяет лучше дискриминировать популяции, чем гейтирование по рассеянию.
Необходимой процедурой является исследование жизнеспособности клеток. Погибшие клетки неспецифично связывают антитела и, следовательно, могут приводить к ложно-положительным результатам.
Важно, чтобы перед тестированием образцов пациентов проточный цитометр был оптимально выровнен, трубки фотоумножителя были настроены для оптимального обнаружения сигнала, и выполнялась компенсация прибора, чтобы исключить появление нежелательного сигнала в канале, отличном от конкретного интересующего канала. Это достаточно простая проблема в 2 или 3 цветных окрасках; однако в 8–10 цветных окрасках это становится слишком сложным, чтобы делать это вручную, и требует, чтобы компьютерные алгоритмы отслеживали множественные области перекрытия сигналов.
Контроль
-1-
Автофлуоресценция
Лазеры возбуждают не только флуорохромы, но и молекулы в клетке, такие как флавопротеины, NADPH, липиды и т.д. Чем больше составляющих клетки, тем сильнее автофлуоресценция! Автофлуоресценция зависит от длины волны возбуждения.
-2-
Анализ неспецифического связывания
проводят с помощью изотипического контроля. Использование контрольных материалов позволяет валидировать применяемые настройки инструмента и, следовательно, является контролем достоверности работы.
-3-
Контроль спектрального перекрывания
зависит от выбора антител и флюорохромов. Флуорохромы с минимальным или нулевым спектральным перекрытием упрощают компенсацию. С участием тандемных красителей возможно возбуждать и детектировать сигнал до 5 флуорохромов одним лазером. Необходимо: одноцветное окрашивание для каждого флуорохрома на панели. Для анализа спектрального перекрытия должны рассматриваться яркие сигналы Компенсация зависит от настройки напряжения. Слабоэкспрессирующиеся антигены лучше работают с ярким красителем. Сильноэкспрессирующеся антигены работают со всеми красителями. Слабоэкспрессируемые антигены лучше работают на каналах, которые не подвержены воздействию спектрального перекрывания. Яркие антигены лучше работают на каналах, которые не воздействуют спектральным перекрыванием на другие каналы. Допускается спектральное перекрывание между взаимоисключающими маркерами (например, CD3 и CD19, или CD4 и CD8).
Концепция контроля качества при работе на ПЦ:
- системная проверка (ежедневно)- проточная система+лазер (мощность лазера должна документироваться ежедневно),
- стандартизация настроек детектора,
- настройка инструмента,
- компенсация,
- спектральное перекрывание,
- контрольный материал,
- проверка результатов,
- документрование,
- контроль качества (QC),
- результаты QC модуля,
- анализ образцов пациентов,
- получение результатов,
- подготовка отчета, обслуживание прибора.
Обязательное участие во внешней оценке качества
Программы внешнего контроля качества External Quality Assessment (EQA) приняты во всем мире как бесценные средства для оценки лабораториями работы своих тестирующих систем. Результаты объективно сравниваются с результатами других лабораторий, использующих ту же методологию для каждого параметра.
Вопросы интерпретации данных в онкогематологии
Корректная интерпретация данных проточной цитометрии особенно важна в онкогематологии, от нее зависит диагноз, лечение и прогнозирование течения болезни. После проверки потенциальных преаналитических и аналитических переменных для обеспечения высококачественных проточных цитометрических данных необходимо учитывать несколько факторов для достижения точной и последовательной интерпретации данных.
Основа ПЦ для распознавания гематопоэтической неоплазии основана на принципе
аномальные клетки, включающие гематопоэтическое новообразование, отличаются по иммунофенотипу от нормальных аналогов, что позволяет распознавать неопластические гематопоэтические клетки методом проточной цитометрии. Следует отметить, что иммунофенотип, связанный с нормальным кроветворением, не является статичным и характеризуется сдвигами в экспрессии антигена, которые происходят во время созревания и с различными состояниями активации. Характер экспрессии антигена, связанный с нормальными гемопоэтическими клетками, также может варьироваться в зависимости от типа образца.
Неопластические популяции могут напоминать состояние созревания или активации, но будут демонстрировать аберрантные иммунофенотипические паттерны, отсутствующие при нормальных обстоятельствах. Экспрессия антигена может быть увеличена, уменьшена или отсутствует по сравнению с нормальным аналогом. Кроме того, аномальные популяции могут экспрессировать антиген, обычно не экспрессируемый на какой-либо стадии нормального развития (например, экспрессия нелинейного антигена или сверхэкспрессия онкогена). Таким образом, основа для интерпретации данных проточной цитометрии для идентификации кроветворных новообразований в значительной степени опирается на глубокое понимание нормальных иммунофенотипических паттернов. Рисунок 6 характеризует несколько примеров экспрессии антигена в лимфоидных новообразованиях с акцентом на то, как эти паттерны отличаются от нормальных аналогов.
Рисунок 6
Нормальные аналоги по сравнению с неопластической популяцией. На всех графиках показаны CD19 + В-клетки. Нормальные / реактивные образцы показаны слева, в то время как опухолевая популяция (светло-синяя) присутствует в образцах справа.
(а) нормальный костный мозг;
(б) костный мозг, вовлеченный в B-лимфобластный лейкоз (B-LL). Нормальный костный мозг содержит гематогоны, которые экспрессируют CD10 и CD38 на высоких уровнях. В примере B-LL, показанном на (b), неопластические клетки показаны светло-голубым цветом и показывают яркий CD10 с низкой, переменной экспрессией CD38. Этот паттерн экспрессии CD10 и CD38 является аберрантным и не виден в нормальном костном мозге (стрелка).
(в) нормальная кровь;
(г) кровь, вовлеченная в хронический лимфолейкоз (ХЛЛ). Нормальная периферическая кровь может содержать популяцию рактивных CD5+ B-клеток, которые демонстрируют политипную экспрессию поверхностной легкой цепи (каппа = синий, лямбда = красный) и нормальные уровни CD20. В отличие от D) аномальные клетки, наблюдаемые при CLL, демонстрируют сильную экспрессию CD5 с аберрантно низким CD20, что позволяет легко отделиться от нормальных фоновых B-клеток.
(д) Фолликулярная гиперплазия может наблюдаться в реактивных лимфатических узлах и демонстрирует экспрессию CD38 (повышенная) и CD10.
(f) Напротив, опухолевые клетки при фолликулярной лимфоме демонстрируют экспрессию CD10, но с низким или отсутствующим CD38. Кроме того, фолликулярная лимфома обычно демонстрирует монотипическую экспрессию поверхностной легкой цепи, более низкую интенсивность CD19 и повышенный уровень BCL-2 по сравнению с реактивной фолликулярной гиперплазией (данные не показаны).
Нормальные аналоги по сравнению с неопластической популяцией. На всех графиках показаны CD19 + В-клетки. Нормальные / реактивные образцы показаны слева, в то время как опухолевая популяция (светло-синяя) присутствует в образцах справа.
(а) нормальный костный мозг;
(б) костный мозг, вовлеченный в B-лимфобластный лейкоз (B-LL). Нормальный костный мозг содержит гематогоны, которые экспрессируют CD10 и CD38 на высоких уровнях. В примере B-LL, показанном на (b), неопластические клетки показаны светло-голубым цветом и показывают яркий CD10 с низкой, переменной экспрессией CD38. Этот паттерн экспрессии CD10 и CD38 является аберрантным и не виден в нормальном костном мозге (стрелка).
(в) нормальная кровь;
(г) кровь, вовлеченная в хронический лимфолейкоз (ХЛЛ). Нормальная периферическая кровь может содержать популяцию рактивных CD5+ B-клеток, которые демонстрируют политипную экспрессию поверхностной легкой цепи (каппа = синий, лямбда = красный) и нормальные уровни CD20. В отличие от D) аномальные клетки, наблюдаемые при CLL, демонстрируют сильную экспрессию CD5 с аберрантно низким CD20, что позволяет легко отделиться от нормальных фоновых B-клеток.
(д) Фолликулярная гиперплазия может наблюдаться в реактивных лимфатических узлах и демонстрирует экспрессию CD38 (повышенная) и CD10.
(f) Напротив, опухолевые клетки при фолликулярной лимфоме демонстрируют экспрессию CD10, но с низким или отсутствующим CD38. Кроме того, фолликулярная лимфома обычно демонстрирует монотипическую экспрессию поверхностной легкой цепи, более низкую интенсивность CD19 и повышенный уровень BCL-2 по сравнению с реактивной фолликулярной гиперплазией (данные не показаны).
Поскольку популяции опухолей характеризуются аберрантными физическими и иммунофенотипическими свойствами, эти популяции могут уклоняться от типичных стратегий гейтирования. Лимфоидные гейты, основанные на прямом и SSC или CD45 против SSC свойствах, могут быть общей отправной точкой для идентификации лимфоидных популяций. Хотя эта стратегия будет эффективна при выявлении большинства лимфоидных новообразований от маленького до среднего размера, крупноклеточная лимфома (и волосатоклеточный лейкоз) может иметь улучшенные рассеивающие свойства, удаляя часть или всю опухолевую популяцию из стандартных лимфоидных гейтов). Точно так же бластные гейты, определяемые CD45 и SSC, часто являются отправной точкой для выявления аномальных предшественников при оценке образца для острого лейкоза; однако, острый промиелоцитарный лейкоз, как правило, демонстрирует повышенную SSC, часто удаляя большую часть опухолевой популяции из стандартного CD45 по сравнению с SSC-определенными бластными гейтами. В таких случаях опухолевая популяция может чрезмерно гранулоцитарной популяции в проекции CD45 против SSC. Подобно тому, как физические свойства могут изменяться в опухолевых популяциях, экспрессия антигена может изменяться и мешать стандартным стратегиям стробирования. Двумя часто встречающимися примерами этого явления являются лимфобластный лейкоз/лимфома, которые могут быть отрицательными для CD45 и избегать стандартного CD45 в сравнении с SSC-определенными бластными гейтами и новообразованиями Т-клеток, который может показывать отсутствие или снижение интенсивности одного или нескольких Т-клеточных антигенов, включая в некоторых случаях CD3. Поскольку свойства разброса, CD45 и маркеры происхождения могут использоваться для стробирования, очень важно не ограничивать поиск неопластической популяции одной популяцией, а скорее оценивать данные дополнительными способами, используя более одного параметра. Например, при оценке на острый лейкоз не ограничивайте поиск предшественников или бластов CD45 в сравнении с SSC-определенными бластными гейтами, а скорее рассматривайте все клетки в образце, используя несколько маркеров, которые могут быть экспрессированы популяцией предшественников. Точно так же, хотя оценка Т-клеток может начинаться с оценки лимфоидных клеток, экспрессирующих маркеры, включая CD3
В то время как идентификация аномальной популяции с помощью ПЦ часто является критическим этапом при определении того, вовлечен ли образец в новообразование; данные проточной цитометрии должны рассматриваться в соответствующем клиническом и морфологическом контексте, чтобы установить точный диагноз в большинстве случаев. Существует, например, несколько обстоятельств, при которых можно идентифицировать иммунофенотипически аберрантную популяцию лимфоцитов, которая не представляет лимфому. Например, монотипические, но реактивные популяции В-клеток или Т-клеток могут наблюдаться в воспалительных состояниях. Что касается В-клеток, фолликулярная гиперплазия редко описывается как перекошенная или монотипическая форма легкой цепи. Аналогично, реактивные клоны Т-клеток были описаны при различных воспалительных состояниях или в условиях хронической антигенной стимуляции. В некоторых случаях такие популяции Т-клеток могут даже демонстрировать паттерны экспрессии антигена, которые классически можно считать ненормальными. Например, в условиях хронической антигенной стимуляции, вызванной цитомегаловирусом (ЦМВ), можно увидеть CD4-позитивные Т-клетки, которые коэкспрессируют CD8 низкого уровня с CD56 и демонстрируют клон Т-клеток. В дополнение к таким реактивным популяциям можно наблюдать небольшие клональные популяции в периферической крови или тканях, которые имеют иммунофенотипические признаки, отражающие лимфоидное новообразование, но с морфологическими и клиническими признаками, которые не позволяют четко поставить диагноз лимфомы или лейкемии. Несколько таких объектов были определены Всемирной организацией здравоохранения и включают моноклональный В-клеточный лимфоцитоз, частота которого увеличивается с возрастом и чаще всего демонстрирует иммунофенотип, перекрывающийся с хроническим лимфоцитарным лейкозом / малым лимфоцитарным лейкозом, а также фолликулярной неоплазией in situ и мантией in situ.
Корреляция данных проточной цитометрии с клиническими и морфологическими данными позволит отделить реактивную, но монотипическую популяцию, моноклональный В-клеточный лимфоцитоз и неоплазию in situ от явной лимфомы или лейкемии
Дополнительное предостережение
Следует учитывать при интерпретации данных проточной цитометрии, является наблюдение, что негематопоэтические новообразования могут иногда экспрессировать гематопоэтические маркеры. Например, CD56 обычно экспрессируется в солидных опухолях, происходящих из эпителия. Поскольку в некоторых случаях при негематопоэтических новообразованиях можно наблюдать экспрессию одного или нескольких гематопоэтических антигенов, следует проявлять осторожность при интерпретации данных, а данные проточной цитометрии следует рассматривать в соответствующем клиническом и морфологическом контексте.
Важно признать, что нормальные паттерны не являются статичными и могут изменить настройку терапии. Способ изменения экспрессии антигена зависит от типа проводимой терапии и временного интервала с момента самой последней терапии. По этой причине крайне важно интерпретировать данные проточной цитометрии в соответствующем терапевтическом контексте. Например, традиционные химиотерапевтические схемы лечения острого лейкоза могут привести к неспецифическому уничтожению быстро делящихся клеток, что приводит к панцитопении и общему снижению клеточности образцов, таких как костный мозг или кровь, в дни и недели после терапии. В зависимости от интенсивности проводимой терапии можно увидеть различия в количестве и качестве нормальных регенерирующих популяций предшественников в разные моменты времени. Таргетная терапия обычно используется отдельно или в комбинации при различных гематопоэтических новообразованиях. Нормальные паттерны, встречающиеся у пациентов, получающих целевую терапию, могут сильно отличаться от паттернов регенерации костного мозга в условиях обычной терапии.
Целевая терапия не только изменяет паттерны нормальных фоновых клеток, но также может изменять иммунофенотип опухолевой популяции. Часто встречающееся явление — потеря целевого антигена в опухолевой популяции. Это может иметь значение для выявления остаточных заболеваний. Например, CD19 экспрессируется на большинстве нормальных В-клеток на всех стадиях созревания, а также на большинстве незрелых и зрелых новообразований В-клеток. Эта особенность обычно делает CD19 и отличным стробирующим реагентом для идентификации как нормальных популяций B-клеток, так и новообразований B-клеток. Однако полезность этого реагента снижается при назначении методов лечения, нацеленных на этот антиген, так как рецидивы после терапии могут быть CD19-отрицательными.
Важно признать, что нормальные паттерны не являются статичными и могут изменить настройку терапии. Способ изменения экспрессии антигена зависит от типа проводимой терапии и временного интервала с момента самой последней терапии. По этой причине крайне важно интерпретировать данные проточной цитометрии в соответствующем терапевтическом контексте. Например, традиционные химиотерапевтические схемы лечения острого лейкоза могут привести к неспецифическому уничтожению быстро делящихся клеток, что приводит к панцитопении и общему снижению клеточности образцов, таких как костный мозг или кровь, в дни и недели после терапии. В зависимости от интенсивности проводимой терапии можно увидеть различия в количестве и качестве нормальных регенерирующих популяций предшественников в разные моменты времени. Таргетная терапия обычно используется отдельно или в комбинации при различных гематопоэтических новообразованиях. Нормальные паттерны, встречающиеся у пациентов, получающих целевую терапию, могут сильно отличаться от паттернов регенерации костного мозга в условиях обычной терапии.
Целевая терапия не только изменяет паттерны нормальных фоновых клеток, но также может изменять иммунофенотип опухолевой популяции. Часто встречающееся явление — потеря целевого антигена в опухолевой популяции. Это может иметь значение для выявления остаточных заболеваний. Например, CD19 экспрессируется на большинстве нормальных В-клеток на всех стадиях созревания, а также на большинстве незрелых и зрелых новообразований В-клеток. Эта особенность обычно делает CD19 и отличным стробирующим реагентом для идентификации как нормальных популяций B-клеток, так и новообразований B-клеток. Однако полезность этого реагента снижается при назначении методов лечения, нацеленных на этот антиген, так как рецидивы после терапии могут быть CD19-отрицательными.
Терапия может изменить внешний вид нормальной популяции. Спектр иммунофенотипов, определяющих нормальное созревание, может изменяться под влиянием терапии.
ПЦ является мощным инструментом для характеристики кроветворных клеток и играет важную роль в диагностике и классификации многих гематопоэтических новообразований, а также некоторых неопухолевых состояний. Полное понимание потенциальных ловушек, которые могут возникнуть на доаналитической и аналитической стадиях, включая подготовку образцов, сбор данных и интерпретацию данных, является критическим элементом, необходимым для получения высококачественных данных проточной цитометрии.
ПЦ является мощным инструментом для характеристики кроветворных клеток и играет важную роль в диагностике и классификации многих гематопоэтических новообразований, а также некоторых неопухолевых состояний. Полное понимание потенциальных ловушек, которые могут возникнуть на доаналитической и аналитической стадиях, включая подготовку образцов, сбор данных и интерпретацию данных, является критическим элементом, необходимым для получения высококачественных данных проточной цитометрии.
