ИЛМ

Лекция №3

Галымжан Сейтгалиев

На сегодняшний день существует несколько основных способов детекции результатов ПЦР:

Электрофоретический

(в агарозном или полиакриламидном геле)

Гибридизационно – ферментный

Гибридизационо – флуоресцентный

регистрация продукта после окончания реакции амплификации – «анализ по конечной точке»
детекция продукта в режиме «реального времени»

Электрофоретический метод

Метод основан на разделении молекул ДНК по размеру. Визуализацию результатов проводят в пластине агарозного геля, который представляет собой застывшую после расплавления в электрофорезном буфере агарозу в концентрации 1,5-2,5% с добавлением специального красителя ДНК, например бромистого этидия.

Застывшая агароза образует пространственную решетку. При заливке с помощью гребенок в геле формируют лунки, в которые вносят продукты амплификации. Пластину геля помещают в аппарат для горизонтального гель-электрофореза и подключают источник постоянного напряжения.

Отрицательно заряженная ДНК начинает двигаться в геле от минуса к плюсу. При этом более короткие молекулы ДНК движутся быстрее, чем длинные. На скорость движения ДНК в геле влияют:

концентрация агарозы
напряженность электрического поля
температура
состав электрофорезного буфера
в меньшей степени, ГЦ-состав ДНК.

Краситель встраивается (интеркалирует) плоскостными группами в молекулы ДНК.

Все молекулы одного размера движутся с одинаковой скоростью. После окончания электрофореза, продолжающегося от 10 мин до 1 часа, гель помещают на фильтр трансиллюминатора, который излучает свет в ультрафиолетовом диапазоне (254 – 310 нм). Энергия ультрафиолета, поглощаемая ДНК в области 260 нм, передается на краситель, заставляя его флуоресцировать в оранжево-красной области видимого спектра (590 нм).

Яркость полос продуктов амплификации может быть различной, поэтому часто в ПЦР-лабораториях принято оценивать результат по трех-, четырех- или пятибалльной системе. Однако, как уже отмечалось ранее, это нельзя связывать с начальным количеством ДНК-мишени в образце.
Часто уменьшение яркости свечения полос связано со снижением эффективности амплификации под влиянием ингибиторов или других факторов.

Метод вертикального электрофореза

Метод вертикального электрофореза принципиально схож с горизонтальным электрофорезом.
Их отличие заключается в том, что в данном случае вместо агарозы используют полиакриламид и специальную камеру для вертикального электрофореза. Электрофорез в полиакриламидном геле имеет большую разрешающую способность по сравнению с агарозным электрофорезом и позволяет различать молекулы ДНК с точностью до одного нуклеотида.
Поскольку необходимость определить размер продукта амплификации с точностью до 1 нуклеотида в клинической лаборатории возникает редко, то в рутинной работе этот метод не используют.

Оба варианта электрофоретической детекции позволяют осуществлять только качественный анализ и сопряжены с рядом проблем:

1 Большие затраты времени на стадию детекции

2 Невозможность автоматизации

3 Сложность и субъективность трактовки результатов

4 Высокий риск контаминации и большие затраты на ее устранение:

повышенные требования к организации лаборатории;
максимальное удаление зоны детекции от других зон проведения ПЦР;
выделение отдельного сотрудника на стадию детекции;
постоянный контроль смывов;
большое количество К- для контроля контаминации ампликонами и, как следствие, увеличение объема расходных материалов и времени для подготовки к проведению детекции.

Метод гибридизации после амплификации

Способ основан на гибридизации олигонуклеотидных зондов с продуктами амплификации. Зонды представляют собой искусственно синтезированные участки ДНК, содержащие ту или иную метку, детектируемую специальными приборами.
Для детекции продуктов ПЦР после окончания реакции амплификации необходимо специальное оборудование – детектор флуоресценции (например, приборы «Джин» или «Джин-4» производства НПФ «ДНК-Технология»).

В процессе своей работы прибор регистрирует флуоресцентное излучение, возникающее в реакционной смеси при освещении образца источником возбуждающего света. Регистрация производится последовательно для каждой из пробирок при её позиционировании относительно оптического блока с помощью шагового двигателя. Флуорофоры для каждой из мишеней (например, для специфического искомого участка ДНК и внутреннего контроля) имеют свою длину волны, это позволяет регистрировать одновременно несколько сигналов по соответствующим каналам, что повышает производительность метода. Такой подход позволяет свести к минимуму риск контаминации продуктами амплификации. Детекция результатов проводится в закрытых пробирках, что позволяет осуществлять ПЦР-исследования в одной комнате и обходиться меньшим количеством персонала.

Кроме того, регистрация, интерпретация и хранение полученных результатов проводятся автоматически. В результате указанный способ детекции существенно сокращает время проведения анализа и исключает возможность субъективной оценки полученных результатов, что повышает качество работы лаборатории.

Тем не менее необходимо помнить, что реализация данного подхода позволяет проводить только качественный анализ. Различные варианты детекции по конечной точке позволяют оценить количество исходной ДНК методом серийных разведений, определяя количество работающих разведений и сравнивая их с контрольными образцами с известной концентрацией ДНК. Однако данный подход является слишком трудоемким и практически не применяется в условиях диагностических лабораторий

Метод гибридизации в процессе амплификации

Данный метод, как упоминалось ранее, позволяет учитывать результаты реакции, не открывая пробирки. Регистрация результатов по уровню флуоресценции происходит с помощью специального оборудования.
Ключевым элементом метода является использование гибридизационных олигонуклеотидных зондов, меченных молекулами флуорофора и «темнового» гасителя.
Наиболее часто применяется флуоресцентный краситель 6-FAM (6-карбоксифлуоресцеин), с длинной волны возбуждения 488 нм, который легко связывается с олигонуклеотидами и обеспечивает высокую интенсивность сигнала. Поэтому под анализ с его использованием адаптированы многие приборы.

Также активно применяют SYBR Green I, который при связывании с двухцепочечной ДНК вызывает увеличение флуоресценции. В качестве референсного красителя широко используется ROX. Для выявления продуктов амплификации применяют следующие наиболее распространенные подходы:
Выщепление 5' концевой метки – метод основан на использовании 5'-экзонуклеазной активности полимеразы. В реакционную смесь добавляют ДНК-зонды, в состав которых входят флуоресцентная метка в 5'-положении, гаситель флуоресценции в 3'-положении, а также фосфатная группа в 3'-положении. Эти зонды имеют места посадки внутри амплифицируемой области. Гаситель поглощает испускаемое флуоресцентной меткой излучение, а фосфатная группа в 3'-положении блокирует полимеразу.

В ходе ПЦР во время стадии отжига праймеров происходит присоединение ДНК-зонда к комплементарной цепи ДНК, причем, чем больше продуктов амплификации образуется в ходе ПЦР, тем больше молекул зондов свяжется с соответствующими ампликонами. Во время стадии элонгации полимераза синтезирует комплементарную цепь ДНК и при достижении зонда начинает его расщеплять благодаря наличию 5'-экзо-нуклеазной активности.

Самой популярной реализацией такого подхода является метод выщепления флуорофора за счет разрушения зонда (TaqMan Assay). В этом случае в реакционной смеси должен присутствовать еще один компонент - специальный одноцепочечный ДНК-зонд: молекула ДНК, комплементарная последовательности амплифицируемого фрагмента, расположенной между праймерами. При этом к одному его концу должен быть химически приделан флуорофор (флуоресцирующая молекула), а к другому – гаситель (молекула, поглощающая энергию флуорофора и «гасящая» флуоресценцию). Когда такой зонд находится в растворе или комплементарно связан с целевой последовательностью, флуорофор и гаситель находятся относительно недалеко друг от друга, и флуоресценции не наблюдается. Однако за счет 3´-экзонуклеазной активности, которой обладает Taq-полимераза (то есть она расщепляет ДНК, на которую «натыкается» в ходе синтеза, и на ее месте синтезирует новую), зонд при синтезе второй цепи разрушается, флуорофор и гаситель за счет диффузии удаляются друг от друга, и появляется флуоресценция.

Hot - start PCR (горячий старт) и 2. Touch - down PCR (и ступенчатая ПЦР)

Высокая специфичность полимеразной цепной реакции обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного возбудителя фрагмент ДНК. Специфичность задается нуклеотидной последовательностью праймеров, что не дает возможность получения ложных результатов в отличие от метода иммуноферментного анализа, где встречаются ошибки в связи с перекрестно - реагирующими антигенами. Методика, которая снижает неспецифическую амплификацию во время начальной настройки этапов ПЦР

RT - PCR (ПЦР с обратной транскрипцией)

В случае если анализируется молекула РНК, а не ДНК, используется ПЦР с обратной транскрипцией. При этом выделяют РНК, из нее с помощью фермента обратной транскриптазы (ревертазы) получают к - ДНК, с которой уже проводят ПЦР. Это удобно в экспериментах по определению того, какие именно гены в данной клетке экспрессируются.

ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР, RT-PCR) используется для идентификации известной последовательности РНК. Суть реакции – синтез двухце- почечной ДНК на матрице одноцепочечной РНК. Для этого одноцепочечную молекулу РНК превращают в реакции обратной транскрипции (ОТ, англ. RT, reverse transcription) в комплементарную ДНК (кДНК) и далее амплифицируют уже ДНК-матрицу, используя традиционную ПЦР.

Использование ревертазы связано с некоторыми трудностями. Прежде всего, данный фермент термолабилен и поэтому может быть использован при температуре не выше 42 °С. Так как при такой температуре молекулы РНК легко образуют вторичные структуры, то эффективность реакции заметно снижается и по разным оценкам приблизительно равна 5 %. Этот недостаток может быть устранен при использовании в качестве обратной транскриптазы термостабильной полимеразы, проявляющей активность в присутствии ионов Мn2+. Это единственный известный фермент, способный проявлять как полимеразную, так и транскриптазную активность.

ОТ-ПЦР широко используется для выявления вирусов, геном которых представлен РНК (ВИЧ, гепатит С, вирусы гриппа и другие), для диагностики генетических заболеваний и полуколичественного определения специфических молекул РНК в клетке или ткани как индикатор экспрессии соответствующих генов

Real - time PCR или qPCR
(количественная ПЦР в реальном времени)

В реакции используются флуоресцентно меченые реагенты и специальный прибор (амплификатор), который рассматривает пробирку и сообщает о концентрации продукта. Ее принципиальной особенностью является мониторинг и количественный анализ накопления продуктов полимеразной цепной реакции, автоматической регистрации и интерпретации полученных результатов. Также кинетика накопления продуктов амплификации связана с исходным количеством матрицы, это дает возможность точно оценить её количество. Эта модификация ПЦР позволяет следить за накоплением ампликонов «в реальном времени».

Мультиплексная (мультипраймерная) ПЦР

одновременная амплификация двух и более искомых последовательностей ДНК в одной пробирке. Каждая пара праймеров для мультиплексной ПЦР должна обладать строгой специфичностью по отношению к соответствующей искомой мишени, а условия циклирования должны обеспечивать равноэффективный отжиг всех участвующих в реакции пар праймеров, чтобы выход амплифицируемых продуктов был по возможности одинаковым. Преимуществом данного метода является возможность проведения скрининговых исследований с минимальными затратами на расходные материалы. Кроме того, из одного образца можно получить максимум информации в рамках одной постановки ПЦР. Тем не менее мультиплексная ПЦР существенно ограничивает возможности при идентификации низкокопийных образцов: если набор реагентов позволяет выявить четыре искомые мишени + внутренний контроль и все четыре мишени присутствуют в исследуемом образце, то в случае преобладающего количества ДНК одной или двух мишеней основной объем компонентов РС будет расходоваться именно на них (конкуренция за компоненты РС). В случае сомнительных результатов мультиплексной ПЦР рекомендуется провести анализ образца с использованием наборов реагентов, предназначенных для выявления одной конкретной мишени. Важно, чтобы мультиплексный и моноплексные наборы реагентов, используемые для проверки сомнительных результатов, были одного производителя

Подбор праймеров

Праймеры являются чрезвычайно важной составляющей любого процесса амплификации, включая ПЦР. Для того чтобы химически синтезированные олигонуклеотидные праймеры (или иным способом приготовленные) могли служить затравочными молекулами для ферментативного синтеза комплементарных цепей ДНК, необходим их отжиг на подходящей одноцепочечной нуклеиновой кислоте с образованием одно/двухцепочечного стартового комплекса с наличием способного к удлинению по одноцепочечной ДНК/РНК-матрице спаренного 3’-конца такого праймера.

Размер праймера должен быть 16-25 нуклеотидов. Меньше 16-ти: слабая связь с мишенью-матрицей

Разница в температуре плавления праймеров - не более 6 градусов ➢ Ц+Г должно быть 50-60 %

Для улучшения качества отжига рекомендуется подбирать праймеры так, чтобы последние несколько нуклеотидов 3' - конца праймера содержали GC-основания

Проверь сбалансированность PCR по нуклеотидам и праймерам Расчёт параметров ПЦР

Отсутствие внутренней вторичной структуры (праймеры не должны быть само- и взаимнокомплиментарными)

Отсутствие комплементарности между 3'-концами (чтобы не образовывалось праймер-димеров)

Оптимальная концентрация праймеров подбирается эмпирически, но не должна быть больше 50 пикомолей на пробирку - иначе начнётся неспецифический отжиг праймеров

Упрощенный расчет оптимальной температуры отжига праймера

Область отжига праймеров должна находиться вне зон мутаций, делеций или инсерций в пределах видовой или иной, взятой в качестве критерия при выборе праймеров, специфичности. При попадании на такую зону, отжига праймеров происходить не будет, и как следствие - ложноотрицательный результат

Преимущества ПЦР

ПЦР позволяет обнаруживать любые ДНК и РНК, даже когда бессильны другие методы. Оборудование, используемое для ПЦР, стандартно, оно не зависит от того, что именно и где именно мы ищем.

В материале, направленном на исследование, определяется уникальная последовательность нуклеотидов, характерная только для конкретного возбудителя. Таким образом, можно говорить, что специфичность метода достигает 100%. Кроме того, это позволяет одновременно, в одном и том же материале, проводить поиск нескольких возбудителей без какого-либо ущерба для качества ответа.

мы уже говорили о том, что возможно найти всего один фрагмент генетического материала возбудителя

Постановка реакции занимает несколько часов, таким образом, вся диагностика, от момента сдачи материала на анализ до получения результата, отнимет всего один день

а не реакцию на его внедрение со стороны организма. Таким образом, появилась возможность точно диагностировать заболевание еще в инкубационном периоде, когда нет никаких клинических или лабораторных признаков болезни.

Метод ПЦР особенно эффективен при выявлении трудно культивируемых, некультивируемых, требующих сложной питательной среды и персистирующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях. Диагностические возможности ПЦР не ограничены способностью микроорганизма расти на искусственных средах или в культуре клеток. Поэтому основное преимущество ПЦР перед культуральными методами состоит не в высокой чувствительности ПЦР-метода (поскольку их чувствительность сопоставима), а в способности идентифицировать, определять свойства и работать с большим разнообразием микроорганизмов, которые не удается по тем или иным причинам размножать в лабораторных условиях.

- ПЦР позволяет осуществить определение патогена или дефектного гена в организме ещё до развития заболевания

возможно проведение ПЦР в пробе, объемом до нескольких микролитров, что крайне важно в неонатологии, судебной медицине, клинической генетике и т.п.

в процессе проведения ПЦР возможность инфицирования персонала исключается, т.к. материал дезинфицируется лизисом и высокой температурой

Позволяет контролировать процесс лечения (количественный метод ПЦР)

фотографии электрофореза, а также отчеты по результатам ПЦР сохраняются в электронном варианте

Недостатки ПЦР

ПЦР не идеальный метод, имеются и свои недостатки. Но они напрямую связаны с его достоинствами и с так называемым «человеческим фактором». ПЦР – очень высокотехнологичный метод, требующий соблюдения строжайших правил оснащения лаборатории. Достаточно сказать, что в помещении должен быть установлен фильтр биологической очистки со степенью 99,9%. Это связано с тем, что в воздухе постоянно присутствует невероятный коктейль из фрагментов ДНК всевозможных живых организмов, и в процессе подготовки к проведению реакции образец может быть загрязнен — возможно «ложное срабатывание

Образец должен брать квалифицированный врач

строго следуя инструкции, которую ему дает лаборатория. Отрицательный результат ПЦР при наличии даже явной клинической картины. Одна из наиболее возможных причин – материал для исследования был взят «не оттуда».

Оценивать результаты ПЦР должен практический врач

который лечит конкретного больного. Далеко не всегда положительный ответ ПЦР означает наличие заболевания. Например, человек пролечился от какого-либо заболевания, но погибший и уже не опасный возбудитель будет еще некоторое время «разбираться на запчасти» защитной системой организма. Если в этот момент сделать ПЦР – результат окажется положительным.

Возможность перекрестной реакции

Существует небольшая вероятность присутствия похожего фрагмента ДНК в другом месте, не связанном с заболеванием, что может привести к ложноположительному результату анализа

Изменчивость генома

Изменение места посадки праймера может привести к ложноотрицательному результату

Разновидности полимеразной цепной реакции:

Hot - start PCR

для повышения специфичности реакции

Touch - down PCR

для повышения специфичности реакции

Allele - specific PCR

для выявления однонуклеотидных различий

RT - PCR (reverse transcriptase PCR)

для амплификации РНК

Asymmetric PCR

для получения одноцепочечного продукта ДНК

Real-time PCR, qPCR

для одновременной амплификации и измерения количества данной молекулы ДНК

Inverse PCR

если известна небольшая последовательность внутри амплифицируемого участка

Nested PCR

для проведения двух последовательных реакций (повышения чувствительности и специфичности)

PCR mutagenesis

если известны два направленного внесения заменяющих последовательность

Вещества ингибирующие ПЦР

Ингибиторы ПЦР - это любой фактор, препятствующий амплификации нуклеиновых кислот посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР). Ингибирование ПЦР - наиболее частая причина неудач амплификации при наличии достаточного количества копий ДНК. Ингибиторы ПЦР обычно влияют на ПЦР через взаимодействие с ДНК или вмешательство в ДНК-полимеразу. Ингибиторы могут избежать удаления во время процедуры очистки ДНК за счет прямого связывания с одноцепочечной или двухцепочечной ДНК. Альтернативно, уменьшая доступность кофакторов (таких как Mg 2+ ) или иным образом препятствуя их взаимодействию с ДНК-полимеразой, ПЦР ингибируется.
Эффективность диагностической ПЦР ограничена наличием ингибиторных веществ в биологических образцах, которые понижают или блокируют способность к амплификации ПЦР в сравнении с чистыми растворами нуклеиновых кислот.
Наличие веществ, мешающих амплификации, будет прямо влиять на качество диагностики с помощью ПЦР и, в частности, на чувствительность обнаружения. Некоторые ингибиторы могут кардинально препятствовать амплификации даже в очень незначительном количестве. Например, ПЦР смеси, содержащие широко используемую полимеразу Taq DNA, полностью подавляются при наличии объемной доли человеческой крови 0.004%. Поэтому, необходимо проводить обработку образцов перед ПЦР для обеспечения амплификации таргетных нуклеиновых кислот при наличии даже следовых количеств веществ, ингибирующих ПЦР.
Ингибиторы ПЦР происходят либо от оригинальных образцов, либо от образцов, полученных в процессе пред-ПЦР подготовки, либо и то и другое.

Механизмы действия ингибиторов разделены на следующие три категории:

деактивация термостабильной ДНК полимеразы

деградация или захват нуклеиновых кислот

препятствование на этапе лизиса клеток

Не взирая на то, что было зарегистрировано большое количество биологических проб, вызывающих ингибирование ПЦР амплификации, природа и биохимические механизмы действия многих ингибиторов все еще остаются неясными.

Ингибиторы ПЦР:

соли желчных кислот;
сложные полисахариды в фекалиях;
коллаген в пищевых пробах
гем в крови
гуминовые вещества в почве
протеиназы в молоке
мочевина в моче.