Галымжан Сейтгалиев
Практическое занятие 1
Генетика – наука, изучающая закономерности и материальные основы наследственности и изменчивости организмов, а также механизмы эволюции живого.
Наследственность - свойство одного поколения передавать другому признаки строения, физиологические свойства и специфический характер индивидуального развития. Свойства наследственности реализуются в процессе индивидуального развития.
Наряду со сходством с родительскими формами в каждом поколении возникают те или иные различия у потомков, как результат проявления изменчивости.
Изменчивость - свойство, противоположное наследственности, заключающееся в изменении наследственных задатков – генов и в изменении их проявления под влиянием внешней среды. Отличия потомков от родителей возникают также вследствие возникновения различных комбинаций генов в процессе мейоза и при объединении отцовских и материнских хромосом в одной зиготе. Здесь надо отметить, что выяснение многих вопросов генетики, особенно открытие материальных носителей наследственности и механизма изменчивости организмов, стало достоянием науки последних десятилетий, выдвинувших генетику на передовые позиции современной биологии.
Основные закономерности передачи наследственных признаков были установлены на растительных и животных организмах, они оказались приложимы и к человеку.
Наследственность - свойство одного поколения передавать другому признаки строения, физиологические свойства и специфический характер индивидуального развития. Свойства наследственности реализуются в процессе индивидуального развития.
Наряду со сходством с родительскими формами в каждом поколении возникают те или иные различия у потомков, как результат проявления изменчивости.
Изменчивость - свойство, противоположное наследственности, заключающееся в изменении наследственных задатков – генов и в изменении их проявления под влиянием внешней среды. Отличия потомков от родителей возникают также вследствие возникновения различных комбинаций генов в процессе мейоза и при объединении отцовских и материнских хромосом в одной зиготе. Здесь надо отметить, что выяснение многих вопросов генетики, особенно открытие материальных носителей наследственности и механизма изменчивости организмов, стало достоянием науки последних десятилетий, выдвинувших генетику на передовые позиции современной биологии.
Основные закономерности передачи наследственных признаков были установлены на растительных и животных организмах, они оказались приложимы и к человеку.
В своем развитии генетика прошла ряд этапов
Первый этап
открытие правил скрещивания организмов и учета признаков у их потомства
Г. Мендель (1865)
открытие дискретности (делимости) наследственных факторов и разработкой гибридологического метода, изучения наследственности.
Дискретность наследственности - отдельные свойства и признаки организма развиваются под контролем наследственных факторов (генов), которые при слиянии гамет и образовании зиготы не смешиваются, не растворяются, а при формировании новых гамет наследуются независимо друг от друга.
Дискретность наследственности - отдельные свойства и признаки организма развиваются под контролем наследственных факторов (генов), которые при слиянии гамет и образовании зиготы не смешиваются, не растворяются, а при формировании новых гамет наследуются независимо друг от друга.
Хуго де Фриз, К. Корренс, Э. Чермак
Значение открытий Г. Менделя оценили после того, как его законы были вновь переоткрыты в 1900 г. тремя биологами независимо друг от друга: де Фризом в Голландии, К. Корренсом в Германии и Э. Чермаком в Австрии. Результаты гибридизации, полученные в первое десятилетие XX в. на различных растениях и животных, полностью подтвердили менделевские законы наследования признаков и показали их универсальный характер по отношению ко всем организмам, размножающимся половым путем. Закономерности наследования признаков в этот период изучались на уровне целостного организма (горох, кукуруза, мак, фасоль, кролик, мышь и др.).
Менделевские законы наследственности заложили основу теории гена – величайшего открытия естествознания XX в., а генетика превратилась в быстро развивающуюся отрасль биологии.
В 1901–1903 гг. де Фриз выдвинул мутационную теорию изменчивости, которая сыграла большую роль в дальнейшем развитии генетики.
Менделевские законы наследственности заложили основу теории гена – величайшего открытия естествознания XX в., а генетика превратилась в быстро развивающуюся отрасль биологии.
В 1901–1903 гг. де Фриз выдвинул мутационную теорию изменчивости, которая сыграла большую роль в дальнейшем развитии генетики.
В. Иогансен
изучал закономерности наследования на чистых линиях фасоли. Он сформулировал также понятие «популяция» (группа организмов одного вида, обитающих и размножающихся на ограниченной территории), предложил называть менделевские «наследственные факторы» словом ген, дал определения понятий «генотип» и «фенотип».
Второй этап
переход к изучению явлений наследственности на клеточном уровне (питогенетика)
Т. Бовери (1902–1907), У. Сэттон и Э. Вильсон (1902–1907)
Переход к изучению явлений наследственности на клеточном уровне (питогенетика). Т. Бовери (1902–1907), У. Сэттон и Э. Вильсон (1902–1907) установили взаимосвязь между менделевскими законами наследования и распределением хромосом в процессе клеточного деления (митоз) и созревания половых клеток (мейоз). Развитие учения о клетке привело к уточнению строения, формы и количества хромосом и помогло установить, что гены, контролирующие те или иные признаки, не что иное, как участки хромосом.
Т.Г. Морган
Это послужило важной предпосылкой утверждения хромосомной теории наследственности. Решающее значение в ее обосновании имели исследования, проведенные на мушках дрозофилах американским генетиком Т. Г. Морганом и его сотрудниками (1910–1911). Ими установлено, что гены расположены в хромосомах в линейном порядке, образуя группы сцепления. Число групп сцепления генов соответствует числу пар гомологичных хромосом, и гены одной группы сцепления могут перекомбинироваться в процессе мейоза благодаря явлению кроссинговера, что лежит в основе одной из форм наследственной комбинативной изменчивости организмов. Морган установил также закономерности наследования признаков, сцепленных с полом.
Третий этап
достижения молекулярной биологии, использование методов и принципов точных наук – физики, химии, математики, биофизики и др. – изучение явлений жизни на уровне молекул. Объектами генетических исследований стали грибы, бактерии, вирусы.
Дж. Бидл и Э. Татум, 1940
изучены взаимоотношения между генами и ферментами и сформулирована теория «один ген – один фермент»: каждый ген контролирует синтез одного фермента; фермент в свою очередь контролирует одну реакцию из целого ряда биохимических превращений, лежащих в основе проявления внешнего или внутреннего признака организма. Эта теория сыграла важную роль в выяснении физической природы гена как элемента наследственной информации.
Генная инженерия
система приемов, позволяющих биологу конструировать искусственные генетические системы. Генная инженерия основывается на универсальности генетического кода: триплеты нуклеотидов ДНК программируют включение аминокислот в белковые молекулы всех организмов – человека, животных, растений, бактерий, вирусов. Благодаря этому можно синтезировать новый ген или выделить его из одной бактерии и ввести его в генетический аппарат другой бактерии, лишенной такого гена.
Третий, современный этап развития генетики открыл огромные перспективы направленного вмешательства в явления наследственности и селекции растительных и животных организмов, выявил важную роль генетики в медицине, в частности, в изучении закономерностей наследственных болезней и физических аномалий человека
И. Мишер
в 1869 году была открыта ДНК. Биологическая функция нового вещества была не ясна.
О. Эвери, К. Мак-Леода и М. Мак-Карти
в 1944 году провели ряд экспериментов по трансформации бактерий, доказавшие, что за трансформацию (приобретение болезнетворных свойств безвредной культурой в результате добавления в нее мертвых болезнетворных бактерий) отвечают выделенные из пневмококков ДНК. Вплоть до 50-х годов XX века точное строение ДНК и способ передачи наследственной информации оставались неизвестными, хотя и было доказано, что ДНК состоит из нескольких цепочек, состоящих из нуклеотидов.
Э. Чаргафф
Количественные соотношения между различными типами азотистых оснований в составе нуклеотидов ДНК были сформулированы в 1949–1951 годах группой биохимика
Э. Чаргаффа. Правила Чаргаффа, наряду с данными рентгеноструктурного анализа, сыграли решающую роль в расшифровке структуры ДНК и определении принципа комплементарности
Э. Чаргаффа. Правила Чаргаффа, наряду с данными рентгеноструктурного анализа, сыграли решающую роль в расшифровке структуры ДНК и определении принципа комплементарности
Дж. Уотсоном и Ф. Криком
В 1953 году ученые пришли к выводу, что ДНК состоит из двух полимерных цепей, удерживаемых водородными связями между азотистыми основаниями и образующих двойную спираль. При этом азотистые основания формируют парные (комплементарные) комплексы аденин – тимин и гуанин – цитозин при взаимодействии цепей нуклеиновых кислот. Каждая цепь служит матрицей при синтезе новой цепи, а последовательность в синтезируемой цепи задается последовательностью комплементарных оснований цепи – матрицы.
А. Корнберг
в 1955 году открыл фермент, который назвал ДНК-поли- меразой. Этот фермент способен удлинять короткие олигонуклеотидные затравки (праймеры), присоединяя к 3’-концу цепи ДНК дополнительный нуклеотид, но для этого необходимо, чтобы праймер был связан с комплементарной цепью ДНК (матрицей). Раствор, в котором происходит эта реакция, должен содержать нуклеозидтрифосфаты (дНТФ), используемые в качестве строительных блоков.
Клеппе
и соавторы в 1971 году представили данные, касающиеся состава ингредиентов реакционной смеси, и принципы использования коротких искусственно синтезированных молекул ДНК-праймеров для получения новых копий ДНК. Однако возможность использования ПЦР в плане наработки большого количества копий нуклеиновых кислот еще не рассматривалась. Это было связано с техническими трудностями, обусловленными необходимостью трудоемкого синтеза праймеров, и нестабильностью фермента. В начале использования метода ПЦР после каждого цикла нагревания – охлаждения ДНК- полимеразу приходилось добавлять в реакционную смесь, так как она быстро инактивировалась при высокой температуре, необходимой для разделения цепей спирали ДНК. Процедура была очень неэффективной, требовала много времени и фермента.
Т. Брок и Х.Фриз
в 1975 году открыли Thermus aquaticus – грамотрицательную палочковидную экстремально термофильную бактерию, а позднее из нее была впервые выделена Taq- полимераза. Taq-полимераза была охарактеризована советскими биохими- ками А. Калединым, А. Слюсаренко и С. Городецким в 1980 году, а также за 4 года до этой советской публикации, то есть в 1976 году, американскими биохимиками Alice Chien, David B. Edgar и John M. Trela.
Преимуществом данного фермента была способность стабильно работать при повышенных температурах (оптимум 72–80°C).
Преимуществом данного фермента была способность стабильно работать при повышенных температурах (оптимум 72–80°C).
К. Мюллис
В 1983–1984 годах (США) провел ряд экспериментов по разработке ПЦР и первым начал использовать Taq-полимеразу вместо неустойчивой к высоким температурам ДНК-полимеразы. Это позволило ускорить работы по разработке полимеразной цепной реакции. Кроме того, К. Мюллис вместе с Ф. Фалуном разработал алгоритм циклических изменений температуры в ходе ПЦР. Таким образом, сформировался принцип использования ПЦР как метода амплификации in vitro заданных фрагментов ДНК с полностью или частично известной последовательностью.
За разработку ПЦР-анализа К. Мюллис в 1993 году был удостоен Нобелевской премии в области химии.
За разработку ПЦР-анализа К. Мюллис в 1993 году был удостоен Нобелевской премии в области химии.
Результатом открытия ПЦР стало почти немедленное практическое применение метода. В 1985 году Saiki с соавт. опубликовали статью, в которой была описана амплификация геномной последовательности β-глобина. С этого момента количество публикаций о применении ПЦР в своих работах стало увеличиваться в геометрической прогрессии. Особенно бурное развитие метод ПЦР получил благодаря международной программе «Геном человека». Были созданы современные лазерные технологии секвенирования (расшифровки нуклеотидных последовательностей ДНК). Это, в свою очередь, способствовало значительному росту информационных баз данных, содержащих последовательности ДНК различных биологических объектов.
Химическое строение и структура ДНК
Вся информация о строении и функционировании любого живого организма содержится в закодированном виде в его генетическом материале. Основу генетического материала организма составляет дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК).
ДНК большинства организмов – это длинная двухцепочечная полимерная молекула. Последовательность мономерных звеньев (дезоксирибонуклеотидов) в одной ее цепи соответствует (комплементарна) последовательности дезоксирибонуклеотидов в другой. Принцип комплементарности обеспечивает синтез новых молекул ДНК, идентичных исходным, при их удвоении (репликации).
Участок молекулы ДНК, кодирующий определенный признак, – ген.
ДНК большинства организмов – это длинная двухцепочечная полимерная молекула. Последовательность мономерных звеньев (дезоксирибонуклеотидов) в одной ее цепи соответствует (комплементарна) последовательности дезоксирибонуклеотидов в другой. Принцип комплементарности обеспечивает синтез новых молекул ДНК, идентичных исходным, при их удвоении (репликации).
Участок молекулы ДНК, кодирующий определенный признак, – ген.
Гены – это индивидуальные генетические элементы, имеющие строго специфичную нуклеотидную последовательность, и кодирующие определенные признаки организма. Одни из них кодируют белки, другие — только молекулы РНК
Информация, которая содержится в генах, кодирующих белки (структурных генах), расшифровывается в ходе двух последовательных процессов:
Синтез РНК (транскрипция)
на определенном участке ДНК как на матрице синтезируется матричная РНК (мРНК)
Синтез белка (трансляция)
в ходе согласованной работы многокомпонентной системы при участии транспортных РНК (тРНК), мРНК, ферментов и различных белковых факторов осуществляется синтез белковой молекулы.
Все эти процессы обеспечивают правильный перевод зашифрованной в ДНК генетической информации с языка нуклеотидов на язык аминокислот.
Аминокислотная последовательность белковой молекулы определяет ее структуру и функции.
Аминокислотная последовательность белковой молекулы определяет ее структуру и функции.
Строение ДНК
ДНК – это линейный органический полимер.
Его мономерные звенья – нуклеотиды, которые, в свою очередь, состоят из:
Строение нуклеотидов в молекуле ДНК
В ДНК моносахарид представлен 2′-дезоксирибозой, содержащей только 1 гидроксильную группу (ОН), а в РНК — рибозой, имеющей2 гидроксильные группы(OH).
Нуклеотиды соединены друг с другом фосфодиэфирными связями, при этом фосфатная группа 5′-углеродного атома одного нуклеотида связана с З’-ОН-группой дезоксирибозы соседнего нуклеотида. На одном конце полинуклеотидной цепи находится З’-ОН-группа (З’-конец), а на другом — 5′-фосфатная группа (5′-конец).
Его мономерные звенья – нуклеотиды, которые, в свою очередь, состоят из:
- азотистого основания;
- пятиуглеродного сахара (пентозы);
- фосфатной группы (рисунок 1).
Строение нуклеотидов в молекуле ДНК
В ДНК моносахарид представлен 2′-дезоксирибозой, содержащей только 1 гидроксильную группу (ОН), а в РНК — рибозой, имеющей2 гидроксильные группы(OH).
Нуклеотиды соединены друг с другом фосфодиэфирными связями, при этом фосфатная группа 5′-углеродного атома одного нуклеотида связана с З’-ОН-группой дезоксирибозы соседнего нуклеотида. На одном конце полинуклеотидной цепи находится З’-ОН-группа (З’-конец), а на другом — 5′-фосфатная группа (5′-конец).
Основания в ДНК бывают двух типов
- Пуриновые: аденин ( А ) и гуанин (G);
- Пиримидиновые: цитозин (С) и тимин (Т).
Уровни структуры ДНК
Первичная структура ДНК
это последовательность расположения нуклеотидов в полинуклеотидной цепи ДНК.
Вторичная структура
стабилизируется водородными связями между комплементарными парами оснований и представляет собой двойную спираль из двух антипараллелных цепочек, закрученных вправо вокруг одной оси. Общий виток спирали- 3,4нм, расстояние между цепочками 2нм.
Третичная структура
суперсперализация ДНК. Двойная спираль ДНК на некоторых участках может подвергаться дальнейшей спирализации с образованием суперспирали или открытой кольцевой формы, что часто вызвано ковалентным соединением их открытых концов. Суперспиральная структура ДНК обеспечивает экономную упаковку очень длинной молекулы ДНК в хромосоме. Так, в вытянутой форме длина молекулы ДНК составляет 8 см, а в форме суперспирали укладывается в 5 нм.
Правило Чаргаффа
Правило Э. Чаргаффа – это закономерность количественного содержания азотистых оснований в молекуле ДНК:
у ДНК молярные доли пуриновых и пиримидиновых оснований равны: А+ G = C + Т или (А + G)/(C + Т)=1
Правило Э. Чаргаффа – это закономерность количественного содержания азотистых оснований в молекуле ДНК:
у ДНК молярные доли пуриновых и пиримидиновых оснований равны: А+ G = C + Т или (А + G)/(C + Т)=1
Модель ДНК Уотсона-Крика
Б 1953 г. Джеймс Уотсони Фрэнсис Крик, основываясь на данных рентгеноструктурного анализа кристаллов ДНК, пришли к выводу, что нативная ДНК состоит из двух полимерных цепей, образующих двойную спираль.
Навитые одна на другую полинуклеотидные цепи удерживаются вместе водородными связями, образующимися между комплементарными основаниями противоположных цепей. При этом аденин образует пару только с тимином, а гуанин — с цитозином. Пара оснований А—Т стабилизируется двумя водородными связями, а пара G—С — тремя.
Длина двухцепочечной ДНК обычно измеряется числом пар комплементарных нуклеотидов (п.н.). Для молекул ДНК, состоящих из тысяч или миллионов пар нуклеотидов, приняты единицы т.п.н.им.п.н. соответственно. Например, ДНК хромосомы 1 человека представляет собой одну двойную спираль длиной 263 м.п.н.
Б 1953 г. Джеймс Уотсони Фрэнсис Крик, основываясь на данных рентгеноструктурного анализа кристаллов ДНК, пришли к выводу, что нативная ДНК состоит из двух полимерных цепей, образующих двойную спираль.
Навитые одна на другую полинуклеотидные цепи удерживаются вместе водородными связями, образующимися между комплементарными основаниями противоположных цепей. При этом аденин образует пару только с тимином, а гуанин — с цитозином. Пара оснований А—Т стабилизируется двумя водородными связями, а пара G—С — тремя.
Длина двухцепочечной ДНК обычно измеряется числом пар комплементарных нуклеотидов (п.н.). Для молекул ДНК, состоящих из тысяч или миллионов пар нуклеотидов, приняты единицы т.п.н.им.п.н. соответственно. Например, ДНК хромосомы 1 человека представляет собой одну двойную спираль длиной 263 м.п.н.
Сахарофосфатный остов молекулы, который состоит из фосфатных групп и дезоксирибозных остатков, соединенных 5’—З’-фосфодиэфирными связями, образует «боковины винтовой лестницы», а пары оснований А—ТиG—С— ее ступеньки .
Цепи молекулы ДНК антипараллельны: одна из них имеет направление 3’→5′, другая 5’→3′. В соответствии с принципом комплементарности, если в одной из цепей имеется нуклеотидная последовательность 5-TAGGCAT-3′, то в комплементарной цепи в этом месте должна находиться последовательность 3′-ATCCGTA-5′. В этом случае двухцепочечная форма будет выглядеть следующим образом:
· 5′-TAGGCAT-3′
· 3-ATCCGTA-5′.
В такой записи 5′-конец верхней цепи всегда располагают слева, а 3′-конец — справа.
Носитель генетической информации должен удовлетворять двум основным требованиям: воспроизводиться (реплицироваться) с высокой точностью и детерминировать (кодировать) синтез белковых молекул.
Цепи молекулы ДНК антипараллельны: одна из них имеет направление 3’→5′, другая 5’→3′. В соответствии с принципом комплементарности, если в одной из цепей имеется нуклеотидная последовательность 5-TAGGCAT-3′, то в комплементарной цепи в этом месте должна находиться последовательность 3′-ATCCGTA-5′. В этом случае двухцепочечная форма будет выглядеть следующим образом:
· 5′-TAGGCAT-3′
· 3-ATCCGTA-5′.
В такой записи 5′-конец верхней цепи всегда располагают слева, а 3′-конец — справа.
Носитель генетической информации должен удовлетворять двум основным требованиям: воспроизводиться (реплицироваться) с высокой точностью и детерминировать (кодировать) синтез белковых молекул.
Модель ДНК Уотсона—Крика полностью отвечает этим требованиям
согласно принципу комплементарности каждая цепь ДНК может служить матрицей для образования новой комплементарной цепи. Следовательно, после одного раунда репликации образуются две дочерние молекулы, каждая из которых имеет такую же нуклеотидную последовательность, как исходная молекула ДНК.
нуклеотидная последовательность структурного гена однозначно задает аминокислотную последовательность кодируемого ею белка
Репликация ДНК
это молекулярный процесс точного копирования молекул ДНК (ее нуклеотидной последовательности). С помощью механизма репликации происходит точная передача генетической информации от клетки к клетке и, таким образом, все клетки многоклеточного организма являются носителями одной и той же наследственной информации. Процесс синтеза ДНК сопровождается множеством событий и является, как правило, точным. Из одной молекулы ДНК синтезируются две идентичные дочерние молекулы. Этот процесс становится возможным благодаря структурным особенностям молекулы ДНК: - двухцепочечная структура; - комплементарность и антипараллельность.
Основные характеристики репликации
синтез ДНК является полуконсервативным, так как каждая цепь служит матрицей для синтеза дочерней цепи;
репликация носит двунаправленный характер
репликация носит двунаправленный характер
репликация носит двунаправленный характер
синтез новой цепи осуществляется только в направлении 5'→3'
в репликации участвует значительное количество белковых факторов
Белки аппарата репликации
ДНК-геликазы
осуществляют деспирализацию и денатурацию участка ДНК с использованием энергии гидролиза АТФ и образование репликационной вилки. В связи с наличием двух репликационных вилок, существуют две геликазы, которые передвигаются в разных направлениях от точки инициации репликации
Праймаза
фермент, который инициирует синтез ДНК за счет синтеза небольшого фрагмента, состоящего из 11-12 рибонуклеотидов, - праймера или затравки (РНКпраймер). Геликаза совместно с праймазой образует комплекс - праймосома
Топоизомераза I
разрывает только одну из двух цепей двойной спирали ДНК, расщепляя фосфодиэфирные связи, что предупреждает суперспирализацию молекулы ДНК
Топоизомераза II
ковалентно связывается с обеими цепями двойной спирали ДНК и вносит в нее на время двухцепочечный разрыв
Белки, связывающиеся с одноцепочечной ДНК
(SSB – белки)
(SSB – белки)
это факторы, стабилизирующие одноцепочечную ДНК в области денатурации и препятствующие комплементарному спариванию двух цепей или различных участков одной и той же цепи, имеющих палиндромные последовательности
ДНК-полимеразы
ферменты, способные синтезировать новые цепи ДНК с матричной цепи
Для репликации ДНК необходимо наличие
1) четырех видов дезоксирибонуклеозид-5- трифосфатов;
2) матрицы в виде двухцепочечной ДНК;
3) затравки (праймера);
4) ферментов и регуляторных факторов;
5) ионов металлов (Mg2+, Mn2+).
Рост цепи ДНК происходит в направлении от 5' к 3' концу. Субстратами реакции является 3'-конечная ОН-группа дезоксирибозы растущей цепи и дезоксирибонуклеозидтрифосфаты. Фермент, который катализирует эту реакцию - ДНК-зависимая ДНК-полимераза. Синтез ДНК с подобными механизмами осуществляется также при репарации повреждений и других процессах.
Механизм репликации в прокариот
Каждая стадия репликации происходит при участии соответствующих ферментов и белковых факторов. Репликация ДНК начинается с небольшого участка - ориджина (origin), где осуществляется инициация процесса, главным моментом которой является расхождение цепей ДНК. Далее по ходу репликации такой репликативный пузырь разрастается в двух противоположных направлениях. На каждой стороне пузыря существует так называемая репликативная вилка, в основе которой и происходит синтез ДНК. Участок ДНК, где осуществляется репликация и начинается с одной точки, называют репликоном.
Средняя скорость репликации на одну репликативную вилку составляет ~ 750 нуклеотидов в секунду у бактерий, 60-90 нуклеотидов в секунду у эукариотов. Синтез бактериальной хромосомы происходит за ~ 50 минут, полная репликация ДНК эукариотической клетки - за несколько часов.
Каждая стадия репликации происходит при участии соответствующих ферментов и белковых факторов. Репликация ДНК начинается с небольшого участка - ориджина (origin), где осуществляется инициация процесса, главным моментом которой является расхождение цепей ДНК. Далее по ходу репликации такой репликативный пузырь разрастается в двух противоположных направлениях. На каждой стороне пузыря существует так называемая репликативная вилка, в основе которой и происходит синтез ДНК. Участок ДНК, где осуществляется репликация и начинается с одной точки, называют репликоном.
Средняя скорость репликации на одну репликативную вилку составляет ~ 750 нуклеотидов в секунду у бактерий, 60-90 нуклеотидов в секунду у эукариотов. Синтез бактериальной хромосомы происходит за ~ 50 минут, полная репликация ДНК эукариотической клетки - за несколько часов.
Основные этапы репликации
1
Расплетающие белки разрывают водородные связи между комплементарными основаниями двойной спирали ДНК. В последнее время установлено, что цепи ДНК раскручиваются не полностью, а на коротком участке под влиянием расплетающих ферментов. Здесь образуется расплетенный участок, напоминающий своей формой латинскую букву V и получивший название «репликативной вилки». Характерно и то, что дальнейшее перемещение репликативной вилки возможно только при раскручивании материнской ДНК и одновременном синтезе обеих новых цепей ДНК. Процесс расплетания двойной спирали (т. е. образование репликативной вилки) осуществляется ДНК-геликазами - АТФзависимыми ферментами. Скорость расплетания ДНК отдельной геликазой равна ~ 35 нуклеотидов в секунду.
2
Затравочная ДНК-зависимая РНК-полимераза (РНКполимераза или праймаза) - образует небольшую РНК-затравку (примерно 10 нуклеотидов) на одном из расплетенных цепей ДНК в направлении 5`,3`. Состав и порядок нуклеотидов в затравке задается ДНК-матрицей, а сшивка их 3`, 5`-фосфодиэфирнимы связями осуществляется РНК-полимеразой. Необходимость синтеза РНК-затравки обусловлена тем, что основной фермент репликации - ДНК-полимераза - не способна самостоятельно начать синтез новой ДНК в направлении 5`, 3` без затравки; она может только продлевать новую полинуклеотидную цепь. В отличие от ДНК-полимеразы, праймаза одинаково включает в праймер как дезоксирибо- так и рибонуклеотиды. Праймер является фрагментом именно РНК потому, что внутриклеточная концентрация рибонуклеозидтрифосфатов выше.
3
ДНК-полимеразы
У прокариот в процессе репликации участвуют три формы ДНК-полимеразы (I, II, III). Все они проявляют два вида активности: полимеразную - сшивают дезоксирибонуклеотиды 3', 5'-фосфодиэфирными связями и нуклеазноую - гидролизуют фосфодиэфирные связи в случае образования ошибок в полинуклеотидной цепи. ДНК-полимераза I действует как РНК-аза, расщепляя РНК-затравку и синтезируя на ее месте комплементарный фрагмент ДНК, которого не хватает. ДНК-полимераза II проявляет очень низкую полимеразную активность. Ее функции в репликации мало изучены. ДНК-полимераза III играет ведущую роль в процессе репликации. Для того, чтобы она могла начать синтез, необходимо существование уже готового небольшого фрагмента ДНК или РНК (затравки), что является комплементарным матрице ДНК и 111 содержит свободную 3'-OH-группу, которая в дальнейшем участвует в полимеразной реакции. ДНК-полимераза III проявляет также 5,3 і 3,5´-ендонуклеазную активность.
4
Рибонуклеаза Н
участвует в гидролизе РНК-затравки вместе с ДНКполимеразой I
5
ДНК-лигазы
сшивающие ферменты. Они участвуют в процессе сообщения друг с другом новосинтезированных фрагментов ДНК, образуя фосфодиэфирные связи
6
Топоизомеразы
Движение репликативной вилки с одновременным разрушением двойной спирали сопровождается прокруткой спирали, что создает положительные надспиральные витки - эластичные напряжения впереди вилки. Эластичное напряжение должно время от времени сниматься, иначе в конце концов оно полностью остановит движение реплисомы. Соответственно, процесс репликации требует вспомогательного действия топоизомераз, основная функция которых как раз и заключается в расслаблении надспирализованой ДНК.
Топоизомеразы I (мономерные белки), которые делятся на два подкласса 1a и 1b, осуществляют разрезание ДНК.
Топоизомеразы 1а (присутствуют как в про-, так и в эукариотах) способны расслаблять только негативно надспирализованную ДНК. Фермент узнает дестабилизированный участок двойной спирали, делает одноцепочечный разрыв и протягивает сквозь него интактную цепь.
Топоизомеразы 1b (только эукариотические) переводят любую ДНК в максимально расслабленное состояние
Топоизомеразы I (мономерные белки), которые делятся на два подкласса 1a и 1b, осуществляют разрезание ДНК.
Топоизомеразы 1а (присутствуют как в про-, так и в эукариотах) способны расслаблять только негативно надспирализованную ДНК. Фермент узнает дестабилизированный участок двойной спирали, делает одноцепочечный разрыв и протягивает сквозь него интактную цепь.
Топоизомеразы 1b (только эукариотические) переводят любую ДНК в максимально расслабленное состояние
В репликативной вилке с большой скоростью осуществляется синтез двух противоположно направленных полинуклеотидных цепей ДНК. Направление одной цепи 3,5 совпадает с направлением движения репликативной вилки. Эту цепь называют лидирующей, ведущей. Вторая цепь называется отстающей (или опаздывающей) - ее синтез также идет в направлении 3,5. Чтобы этот процесс произошел, на второй цепи ДНК в направлении, противоположном движению репликативной вилки, строятся короткие фрагменты, которые затем сшиваются с образованием цепи, которая опаздывает. Это было показано в 1968 г. Р. Оказаки, который установил, что часть синтезированной ДНК находится в виде фрагментов, состоящих из 1000-2000 нуклеотидов.
В дальнейшем эти фрагменты получили название фрагментов Оказаки. Предполагают, что ведущая цепь растет непрерывно, постепенно передвигаясь по репликативной вилке
В дальнейшем эти фрагменты получили название фрагментов Оказаки. Предполагают, что ведущая цепь растет непрерывно, постепенно передвигаясь по репликативной вилке
Начинается репликация (стадия инициации) из образования в нескольких местах ДНК (чаще всего на внутренних ее участках) репликативных вилок под влиянием расплетающих белков. Как уже отмечалось, необходимым условием является наличие в начале новой цепи затравки (праймера), которая содержит на конце свободную 3'-ОНгруппу.
После окончания синтеза РНК-затравки к ее 3'-OH-концу присоединяется ДНКполимераза III. Далее с участием этого фермента происходит присоединение к РНК-затравке дезоксирибонуклеозид-5-трифосфатов с высвобождением пирофосфатов (элонгация). Одновременно ДНК-полимераза III синтезирует на второй материнской цепи репликативной вилки короткие фрагменты Оказаки (синтез происходит челночно). Важным является тот факт, что во время синтеза ДНК-полимераза III может исправлять ошибки в случае неправильного включения нуклеотидов. Если произойдет ошибка, то этот нуклеотид сразу отщепляется ферментом благодаря нуклеазной активности, а при правильном включении нового нуклеотида присоединяет его к уже образованному фрагменту ДНК. Затем РНК-затравка удаляется или рибонуклеазой Н, или ДНКполимеразой I, а на ее месте достраивается цепь ДНК с участием ДНК-полимеразы I.
Соединение синтезированных фрагментов происходит с помощью ДНК-лигазы.
Процесс репликации происходит с достаточно большой скоростью: 1000-2000 нуклеотидов в секунду. Характерна очень большая точность. Так, на 1010 пар нуклеотидов встречается только одна ошибка. Исправление ошибок происходит мгновенно путем их устранения и замены. Например, если в нуклеотиде вместо тимина появляется урацил, то с синтезированной полинуклеотидной цепи этот нуклеотид удаляется и на его место вводится тимидиловая кислота.
После окончания синтеза РНК-затравки к ее 3'-OH-концу присоединяется ДНКполимераза III. Далее с участием этого фермента происходит присоединение к РНК-затравке дезоксирибонуклеозид-5-трифосфатов с высвобождением пирофосфатов (элонгация). Одновременно ДНК-полимераза III синтезирует на второй материнской цепи репликативной вилки короткие фрагменты Оказаки (синтез происходит челночно). Важным является тот факт, что во время синтеза ДНК-полимераза III может исправлять ошибки в случае неправильного включения нуклеотидов. Если произойдет ошибка, то этот нуклеотид сразу отщепляется ферментом благодаря нуклеазной активности, а при правильном включении нового нуклеотида присоединяет его к уже образованному фрагменту ДНК. Затем РНК-затравка удаляется или рибонуклеазой Н, или ДНКполимеразой I, а на ее месте достраивается цепь ДНК с участием ДНК-полимеразы I.
Соединение синтезированных фрагментов происходит с помощью ДНК-лигазы.
Процесс репликации происходит с достаточно большой скоростью: 1000-2000 нуклеотидов в секунду. Характерна очень большая точность. Так, на 1010 пар нуклеотидов встречается только одна ошибка. Исправление ошибок происходит мгновенно путем их устранения и замены. Например, если в нуклеотиде вместо тимина появляется урацил, то с синтезированной полинуклеотидной цепи этот нуклеотид удаляется и на его место вводится тимидиловая кислота.
