Правила получения и подготовки материала для ПЦР-диагностики
Осуществлять взятие клинического материала, строго следуя инструкции, только стерильными одноразовыми инструментами в стерильные одноразовые флаконы, пробирки, контейнеры. Работать в одноразовых перчатках
Взятие клинического материала должно производиться в пробирки с транспортной средой, предоставляемой фирмой-производителем наборов реагентов (в случаях, где использование транспортной среды является необходимым). Недопустимо использование транспортной среды других фирм-производителей.
Сразу после взятия плотно закрывать пробирки, флаконы с клиническим материалом, не касаясь их внутренней поверхности и внутренней поверхности крышек.
При переносе клинического материала из пробирок, флаконов в новые использовать только отдельные одноразовые стерильные наконечники с аэрозольными барьерами
При работе с клиническим материалом, открывая пробирки, флаконы, не производить резких движений и не допускать разбрызгиваний и расплескиваний, что может привести к контаминации проб и рабочих поверхностей
Строго соблюдать правила хранения и транспортирования клинических проб. Охлаждающие элементы перед транспортированием клинического материала замораживать до необходимой температуры
При работах по выделению и очистке РНК из клинического материала использовать расходные материалы (пластиковые пробирки и наконечники) только с маркировкой «DNase-, RNase-free»
Материалы и оборудование, необходимые для получения и предобработки клинического материала для ПЦР-исследований
Получение и хранение материала
| Кровь (плазма), сыворотка крови Пробы крови (плазмы) используют при проведении качественных и количественных исследований, пробы сыворотки крови используют только при проведении качественных исследований с помощью МАНК. Взятие материала Для получения плазмы забор крови производят натощак или через 3 часа после приема пищи из локтевой вены одноразовой иглой (диаметр 0,8 – 1,1 мм) в специальную вакуумную систему (сиреневые крышки – 6% ЭДТА) или одноразовым шприцем в пластиковые пробирки с цитратом натрия (3,8%ный раствор цитрата натрия в соотношении 1:9). Пробирку закрывают крышкой и аккуратно переворачивают несколько раз вверх дном, чтобы кровь в пробирке тщательно перемешалась с антикоагулянтом (в противном случае кровь свернется, и выделение ДНК/РНК станет невозможным). Гепарин в качестве антикоагулянта использовать нельзя !!! Для получения сыворотки забор крови проводят натощак из локтевой вены одноразовой иглой (диаметр 0,8 – 1,1 мм) в одноразовые пробирки без антикоагулянта. Требуется предварительная обработка проб. |
Предварительная обработка биоматериала
Плазма крови
получают центрифугированием пробирок с цельной кровью при 800–1600 g (3000 об./мин на центрифуге «MiniSpin», Eppendorf, Германия) в течение 20 минут при комнатной температуре. Затем отбирают плазму в количестве не менее 1 мл отдельными наконечниками с фильтром (пастеровскими пипетками) в стерильные пробирки объемом 1,5 или 2,0 мл.
Клетки крови
(лейкоцитарную фракцию цельной крови, лейкоцитарную пленку) для выявления лейкотропных вирусов и т.д. следует отбирать после центрифугирования цельной крови и удаления плазмы. Используя наконечник с фильтром аккуратно собрать лейкоцитарную массу с поверхности осадка клеток в объеме 0,2 мл и перенести в стерильную пробирку объемом 1,52,0 мл.
Сыворотка
пробирки с кровью (без антикоагулянта) отстаивают при комнатной температуре в течение 30 минут до полного образования сгустка или помещают в термостат при 37 °С на 15 минут. Затем центрифугируют при 800–1600 g (3000 об./мин на центрифуге «MiniSpin», Eppendorf, Германия) в течение 10 минут при комнатной температуре. Сыворотку переносят отдельными наконечниками с фильтром (пастеровскими пипетками) в стерильные пробирки объемом 1,5 или 2,0 мл. Сыворотка не должна быть гемолизированной.
Сыворотку допустимо использовать только для качественного выявления вирусов гепатитов в случае невозможности получения плазмы; важно помнить, что при свертывании крови часть вируса (ВИЧ, ВГС, ВГБ) остается в кровяном сгустке
Сыворотку допустимо использовать только для качественного выявления вирусов гепатитов в случае невозможности получения плазмы; важно помнить, что при свертывании крови часть вируса (ВИЧ, ВГС, ВГБ) остается в кровяном сгустке
Условия хранения и транспортировки материала
и предварительно обработанных пробОбразцы цельной крови:
- при температуре 20–25 °С — в течение 2 часов;
- при температуре 2–8 °С — в течение 6 ч с момента взятия материала для количественного определения нуклеиновых кислот; в течение 12 ч – для качественного определения нуклеиновых кислот;
Недопустимо замораживание образцов цельной крови!
Образцы плазмы и сыворотки:
- при температуре 2–8 °С — в течение 5 суток;
- при температуре минус 20 °С — в течение года;
- при температуре минус 70 °С — длительно.
Допускается только однократное замораживание-оттаивание материала, поэтому образцы плазмы или сыворотки для длительного хранения желательно разлить небольшими (0,1 – 0,2 мл) порциями в отдельные стерильные пробирки объемом 1,5 мл или 2,0 мл.
Соскоб из цервикального канала
Удаляют слизь и отделяемое влагалища с поверхности шейки матки стерильным марлевым тампоном, вводят рабочую часть цитощетки в цервикальный канал и делают дватри полных оборота по часовой стрелке. Извлекают цитощетку и помещают ее рабочую часть, содержащую взятый материал, в пробирку с транспортной средой. Рабочую часть цитощетки обламывают не более 1 см пластиковой основы цитощетки и оставляют в пробирке с транспортной средой.
Недопустимо использование многоразовых ножниц для обрезания рабочей части цитощетки или универсального зонда – это может привести к перекрестной контаминации клиническим материалом и, как следствие, получению ложноположительных результатов. Допускается лишь однократное замораживаниеоттаивание материала.
Недопустимо использование многоразовых ножниц для обрезания рабочей части цитощетки или универсального зонда – это может привести к перекрестной контаминации клиническим материалом и, как следствие, получению ложноположительных результатов. Допускается лишь однократное замораживаниеоттаивание материала.
Предварительная обработка материала
Перед работой с образцами, тщательно перемешивают содержимое пробирок на вортексе для растворения слизи и получения гомогенной суспензии клеток.
Образцы соскобов эпителия из эндои экзочастей цервикса, взятые комбинированным зондом в пробирку на 5 мл с транспортной средой, при наличии слизи, тщательно перемешивают на вортексе для более полного ее растворения и получения однородной суспензии. Используя наконечник с аэрозольным барьером, переносят 0,5 мл образца в пластиковую пробирку на 1,5 м, центрифугируют 5 минут при 10000 g (12000 об./мин на центрифуге «MiniSpin», Eppendorf, Германия). Удаляют 0,4 мл надосадочной жидкости, осадок клеток перемешивают с 0,1 мл оставшейся жидкости.
Образцы соскобов эпителия из эндои экзочастей цервикса, взятые комбинированным зондом в пробирку на 5 мл с транспортной средой, при наличии слизи, тщательно перемешивают на вортексе для более полного ее растворения и получения однородной суспензии. Используя наконечник с аэрозольным барьером, переносят 0,5 мл образца в пластиковую пробирку на 1,5 м, центрифугируют 5 минут при 10000 g (12000 об./мин на центрифуге «MiniSpin», Eppendorf, Германия). Удаляют 0,4 мл надосадочной жидкости, осадок клеток перемешивают с 0,1 мл оставшейся жидкости.
Условия хранения биоматериала
при комнатной температуре – в течение 48 часов
при температуре 2-8°С – в течение 2 недель
при температуре минус 20°С – в течение 1месяца
при температуре минус 70°С – длительно. Допускается только однократное замораживание-оттаивание материала.
| Моча Для анализа отбирают первую порцию утренней мочи в количестве 15–25 мл в специальный сухой стерильный флакон или контейнер на 50-60 мл. Сбор мочи проводится после тщательного туалета наружных половых органов, чтобы в мочу не попали выделения из них. Также не следует производить сбор мочи во время менструации. |
Предварительная обработка биоматериала
Взбалтывают флакон с мочой. Переносят 1 мл мочи, используя наконечник с фильтром, в стерильную одноразовую пробирку объемом 1,5 мл. Центрифугируют 5 минут при 10000 g (12000 об./мин на центрифуге «MiniSpin», Eppendorf, Германия). При наличии большого количества солей ресуспендируют только верхний слой осадка солей в объеме 1 мл и затем снова концентрируют. Используя вакуумный отсасыватель с колбой-ловушкой, полностью удаляют супернатант, используя для каждого образца отдельный наконечник без фильтра, не захватывая осадок. К осадку добавляют транспортную среду до конечного объема 0,2 мл, тщательно перемешивают содержимое на вортексе.
При исследовании на Leptospira spp. возможно также последовательное концентрирование: сначала 20 мл мочи центрифугировать 10 минут при 9000 g (11000 об./мин на центрифуге «MiniSpin», Eppendorf, Германия), затем осадок и 1 мл надосадочной мочи центрифугировать 10 минут при 11000 g (13000 об./мин на центрифуге «MiniSpin», Eppendorf, Германия).
При исследовании на Leptospira spp. возможно также последовательное концентрирование: сначала 20 мл мочи центрифугировать 10 минут при 9000 g (11000 об./мин на центрифуге «MiniSpin», Eppendorf, Германия), затем осадок и 1 мл надосадочной мочи центрифугировать 10 минут при 11000 g (13000 об./мин на центрифуге «MiniSpin», Eppendorf, Германия).
Условия хранения биоматериала
при температуре 2–8 °С — в течение 1 суток;
при температуре минус 20 °С — в течение 1 недели
при температуре минус 70 °С — длительно.
Допускается только однократное замораживание-оттаивание материала.
Отделяемое уретры мужчин.
Соскоб эпителиальных клеток из уретры мужчин
Соскоб эпителиальных клеток из уретры мужчин
Перед взятием соскоба из уретры обрабатывают головку полового члена в области наружного отверстия уретры тампоном, смоченным стерильным физиологическим раствором.
Вводят зонд в уретру на глубину 1–2 см. Несколькими вращательными движениями производят соскоб эпителиальных клеток и переносят зонд в пробирку с транспортной средой, обламывают и оставляют.
В случае отсутствия насечки погружают рабочую часть зонда в среду и, прижав ее к внутренней стенке пробирки, вращают зонд 5–10 секунд, после чего зонд удаляют, а пробирку плотно закрывают. Следует помнить, что в этом случае значительная часть материала может не попасть в пробирку с транспортной средой и материал будет неадекватным для исследования.
Недопустимо использование ножниц для обрезания рабочей части зонда!
Пробирку плотно закрывают крышкой.
Вводят зонд в уретру на глубину 1–2 см. Несколькими вращательными движениями производят соскоб эпителиальных клеток и переносят зонд в пробирку с транспортной средой, обламывают и оставляют.
В случае отсутствия насечки погружают рабочую часть зонда в среду и, прижав ее к внутренней стенке пробирки, вращают зонд 5–10 секунд, после чего зонд удаляют, а пробирку плотно закрывают. Следует помнить, что в этом случае значительная часть материала может не попасть в пробирку с транспортной средой и материал будет неадекватным для исследования.
Недопустимо использование ножниц для обрезания рабочей части зонда!
Пробирку плотно закрывают крышкой.
Предварительная обработка биоматериала
Перед проведением процедуры экстракции нуклеиновых кислот осаждают капли материала со стенок пробирки и внутренней части крышки центрифугированием (15003000 об/мин в течение 5 секунд), после чего аккуратно перемешивают содержимое пробирки на вортексе, избегая разбрызгивания и попадания материала на внутреннюю часть крышки.
Условия хранения биоматериала
при комнатной температуре – в течение 48 часов
при температуре 2-8°С – в течение 2 недель
Фекалии
Используют пробы фекалий массой (объемом) примерно 1–3 г (1–3 мл). Исследование мазков неинформативно изза низкого содержания в них возбудителей. Пробу в количестве 1 г (примерно) отдельным наконечником с фильтром или одноразовыми лопатками переносят в специальный стерильный флакон.
Требуется предварительная обработка проб.
Требуется предварительная обработка проб.
Предварительная обработка биоматериала
Приготовление фекальной суспензии
В соответствующее пробам количество микроцентрифужных пробирок (объемом 1,5 мл) вносят 0,8 мл фосфатного буфера (или стерильного изотонического раствора натрия хлорида). В каждую пробирку отдельным наконечником с фильтром (или одноразовыми лопатками) вносят 0,1 г (0,1 мл) фекалий и тщательно ресуспендируют на вортексе до образования гомогенной суспензии.
При невозможности исследования материала в течение суток и/или необходимости длительного хранения к 10–20%ной суспензии фекалий в фосфатном буфере (или стерильном изотоническом растворе натрия хлорида) добавляют глицерин в конечной концентрации 10–15%. Подготовленные таким образом пробы замораживают только после тщательной гомогенизации и экспозиции с глицерином в течение 30–40 минут.
При невозможности исследования материала в течение суток и/или необходимости длительного хранения к 10–20%ной суспензии фекалий в фосфатном буфере (или стерильном изотоническом растворе натрия хлорида) добавляют глицерин в конечной концентрации 10–15%. Подготовленные таким образом пробы замораживают только после тщательной гомогенизации и экспозиции с глицерином в течение 30–40 минут.
Приготовление бактериальной фракции фекалий для выявления бактериальных агентов
Для приготовления бактериальной фракции фекалий используют фекалии водянистой консистенции, свежеприготовленную суспензию фекалий или суспензию, подвергавшуюся замораживанию с глицерином.
Пробирки с суспензией (водянистыми фекалиями) центрифугируют при 7000–12000 g (10000–13000 об./мин на центрифуге «MiniSpin», Eppendorf, Германия) в течение 5 минут. Отдельным наконечником с фильтром из каждой пробирки отбирают бактериальную фракцию в объеме 0,05 мл (верхняя беложелтая часть образовавшегося осадка). При отсутствии осадка или беложелтого пограничного слоя между осадком и супернатантом отбирают 0,1 мл со дна пробирки или с границы осадка или супернатанта, соответственно. Отобранную часть пробы, содержащую высокую концентрацию бактерий, переносят в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, содержащей 0,8 мл фосфатного буфера (или стерильного изотонического раствора натрия хлорида). Проводят тщательное ресуспендирование осадка на вортексе с последующим центрифугированием при 7000–12000 g (10000–13000 об./мин на центрифуге «MiniSpin», Eppendorf, Германия) в течение 15 минут.
Супернатант удаляют, а осадок ресуспендируют на вортексе в 0,3 мл фосфатного буфера (стерильного изотонического раствора натрия хлорида).
Пробирки с суспензией (водянистыми фекалиями) центрифугируют при 7000–12000 g (10000–13000 об./мин на центрифуге «MiniSpin», Eppendorf, Германия) в течение 5 минут. Отдельным наконечником с фильтром из каждой пробирки отбирают бактериальную фракцию в объеме 0,05 мл (верхняя беложелтая часть образовавшегося осадка). При отсутствии осадка или беложелтого пограничного слоя между осадком и супернатантом отбирают 0,1 мл со дна пробирки или с границы осадка или супернатанта, соответственно. Отобранную часть пробы, содержащую высокую концентрацию бактерий, переносят в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, содержащей 0,8 мл фосфатного буфера (или стерильного изотонического раствора натрия хлорида). Проводят тщательное ресуспендирование осадка на вортексе с последующим центрифугированием при 7000–12000 g (10000–13000 об./мин на центрифуге «MiniSpin», Eppendorf, Германия) в течение 15 минут.
Супернатант удаляют, а осадок ресуспендируют на вортексе в 0,3 мл фосфатного буфера (стерильного изотонического раствора натрия хлорида).
Приготовление осветленного экстракта фекалий для выявления вирусных агентов
Для приготовления осветленного экстракта фекалий используют фекалии водянистой консистенции, свежеприготовленную суспензию фекалий или суспензию, подвергавшуюся замораживанию с глицерином.
Взвесь фекалий интенсивно гомогенизируют на вортексе. Осветляют полученную суспензию путем центрифугирования при 10000 g (12000 об./мин на центрифуге «MiniSpin», Eppendorf, Германия) в течение 5 минут. Супернатант (0,1 мл) смешивают с отрицательным контрольным образцом (50%ная сыворотка крови крупного рогатого скота, разведенная фосфатносолевым буфером, состав которого указан выше) (0,1 мл) в соотношении 1:1 и используют непосредственно для выделения ДНК или РНК. При необходимости хранения супернатант отбирают в отдельную одноразовую пробирку.
Взвесь фекалий интенсивно гомогенизируют на вортексе. Осветляют полученную суспензию путем центрифугирования при 10000 g (12000 об./мин на центрифуге «MiniSpin», Eppendorf, Германия) в течение 5 минут. Супернатант (0,1 мл) смешивают с отрицательным контрольным образцом (50%ная сыворотка крови крупного рогатого скота, разведенная фосфатносолевым буфером, состав которого указан выше) (0,1 мл) в соотношении 1:1 и используют непосредственно для выделения ДНК или РНК. При необходимости хранения супернатант отбирают в отдельную одноразовую пробирку.
Условия хранения биоматериала
Образцы нативных фекалий:
- при комнатной температуре — в течение 6 часов;
- при температуре 2–8 °С — в течение 3 суток.
Фекальная суспензия с глицерином, бактериальная фракция и осветленный фекальный экстракт:
- при температуре минус 20 °С — в течение 1 недели;
- при температуре минус 70 °С — длительно.
| Мазки из полости носа Мазки (слизь) берут сухими стерильными ватными тампонами на пластиковой основе. Тампон вводят легким движением по наружной стенке носа на глубину 2–3 см до нижней раковины. Затем тампон слегка опускают книзу, вводят в нижний носовой ход под нижнюю носовую раковину, делают вращательное движение и удаляют вдоль наружной стенки носа. После взятия материала тампон (рабочую часть зонда с ватным тампоном) помещают в стерильную одноразовую пробирку с защелкивающейся крышкой, содержащую соответствующую транспортную среду, и аккуратно обламывают пластиковый стержень на расстоянии не более 0,5 см от рабочей части, оставляя рабочую часть зонда с материалом в транспортной среде. Пробирку плотно закрывают крышкой. Предварительная обработка проб не требуется. |
Условия хранения биоматериала
при комнатной температуре — в течение 6 ч.
при температуре 2–8 °С — в течение 3 суток
при температуре минус 20 °С — в течение 1 месяца
при температуре минус 70 °С — длительно.
Допускается только однократное замораживание-оттаивание
материала.
Допускается только однократное замораживание-оттаивание
материала.
Мазки из ротоглотки
Отделяемое следует забирать сухими стерильными ватными тампонами на пластиковой основе вращательными движениями с поверхности миндалин, небных дужек и задней стенки ротоглотки с обязательной фиксацией языка одноразовым шпателем.
После получения материала рабочую часть зонда поместить в стерильную одноразовую пробирку на 1,5-2.0 мл с защелкивающейся крышкой с транспортной средой для хранения и транспортировки респираторных мазков объемом 0,5 мл. Погрузив рабочую часть зонда в транспортную среду, аккуратно обломить пластиковый стержень на расстоянии не более 0,5 см от рабочей части и оставить рабочую часть зонда с материалом в транспортной среде. Пробирку плотно закрыть крышкой, не допуская зазора и смятия внутренней части крышки, и промаркировать.
Предварительная обработка проб не требуется.
После получения материала рабочую часть зонда поместить в стерильную одноразовую пробирку на 1,5-2.0 мл с защелкивающейся крышкой с транспортной средой для хранения и транспортировки респираторных мазков объемом 0,5 мл. Погрузив рабочую часть зонда в транспортную среду, аккуратно обломить пластиковый стержень на расстоянии не более 0,5 см от рабочей части и оставить рабочую часть зонда с материалом в транспортной среде. Пробирку плотно закрыть крышкой, не допуская зазора и смятия внутренней части крышки, и промаркировать.
Предварительная обработка проб не требуется.
Транспортировка биоматериала
- Транспортировку клинического материала осуществлять в специальном контейнере с охлаждающими элементами.
- Транспортировку замороженного клинического материала осуществлять в специальном контейнере с сухим льдом.
Мокрота
Взятие материала осуществляют в количестве не менее 1,0 мл в одноразовые градуированные стерильные флаконы с широким горлом и завинчивающимися крышками объемом не менее 50 мл.
Предварительная обработка биоматериала
Перед выделением нуклеиновых кислот необходимо провести разжижение мокроты, используя раствор «Муколизин» (Na2HPO4 77,4 мМ, NaH2PO4 22,6 мМ, бетаМЭ 99,4 мМ, 5%ный азид натрия в конечной концентрации 0,05%)
В емкость с мокротой добавляют «Муколизин» в соотношении 5:1 (5 частей «Муколизина» к 1 части мокроты), ориентируясь по градуировке емкости, и стерильные стеклянные бусы. В процессе разжижения мокроты (20–30 минут) емкость периодически встряхивают.
Автоматической пипеткой, используя наконечник с фильтром, отбирают 1 мл разжиженной мокроты, помещают в пробирку с завинчивающейся крышкой или в микроцентрифужную пробирку с защелкой на 1,5 мл и центрифугируют при 5000–7000 g (8000–10000 об./мин на центрифуге «MiniSpin», Eppendorf, Германия) в течение 10 минут
Удаляют 0,8 мл надосадочной жидкости, осадок клеток перемешивают с 0,2 мл оставшейся жидкости.
Допускается выделение ДНК/РНК из 0,1 мл разжиженной мокроты без стадии центрифугирования
Допускается выделение ДНК/РНК из 0,1 мл разжиженной мокроты без стадии центрифугирования
Транспортировка биоматериала
При комнатной температуре
в течение 6 часов
При температуре 2–8 °
в течение 3 суток
При температуре минус 20 °С
в течение 1 недели
При температуре минус 70 °С
при температуре минус 70 °С — длительно, допускается лишь однократное замораживание-оттаивание материала.
Выделение (экстракция) нуклеиновых кислот из клинического биоматериала
Процедура выделения ДНК из клеток и тканей часто является исходным этапом в исследовании живого организма на молекулярном уровне.
Впервые изоляция ДНК была осуществлена в 1869 году Фридрихом Мишером. Основной задачей данного этапа является получение очищенного препарата ДНК для последующей реакции амплификации. Качество и частота нуклеиновых кислот относится к наиболее важным факторам успешной постановки ПЦР анализа.
Для того чтобы получить высокоочищенные нуклеиновые кислоты необходимо использовать наиболее подходящие методы выделения ДНК. Так же надо учитывать доступность процедуры в повседневной жизни.
Впервые изоляция ДНК была осуществлена в 1869 году Фридрихом Мишером. Основной задачей данного этапа является получение очищенного препарата ДНК для последующей реакции амплификации. Качество и частота нуклеиновых кислот относится к наиболее важным факторам успешной постановки ПЦР анализа.
Для того чтобы получить высокоочищенные нуклеиновые кислоты необходимо использовать наиболее подходящие методы выделения ДНК. Так же надо учитывать доступность процедуры в повседневной жизни.
Для выделения нуклеиновых кислот из биологических материалов необходимо провести:
1
Разрушение (лизис) клеток
2
Инактивация клеточных нуклеаз
3
Oтделение искомых нуклеиновых кислот от клеточной массы
Часто идеальная процедура экстракции ДНК является компромиссом нескольких методик: она должна быть достаточно жесткой, чтобы разрушить сложную структуру исходного материала (например, тканей), и при этом достаточно деликатной, чтобы оставить в неприкосновенности целевые нуклеиновые кислоты.
Методы выделения ДНК обычно включают следующие этапы:
1. лизис клеток;
2. осаждение белков;
3. центрифугирование для удаления денатурированных белков и фрагментов клеточных органелл;
4. осаждение ДНК из раствора этанолом и после центрифугирования растворение осадка в буферном растворе.
Вместе с ДНК частично выделяется и РНК, от которой избавляются с помощью фермента РНКазы.
2. осаждение белков;
3. центрифугирование для удаления денатурированных белков и фрагментов клеточных органелл;
4. осаждение ДНК из раствора этанолом и после центрифугирования растворение осадка в буферном растворе.
Вместе с ДНК частично выделяется и РНК, от которой избавляются с помощью фермента РНКазы.
Способы лизиса клеток
- механическое разрушение (с помощью гипотонического раствора и/или с применением ультразвука),
- химическая обработка (лизис с помощью детергентов и хаотропных агентов) и ферментативное расщепление белков (протеинкиназа К).
Осаждение белков
Экстракция растворителями
часто используется для удаления примесей из нуклеиновых кислот. Например, комбинация растворителей: фенол и хлороформ часто используется для осаждения и удаления белков. Если содержание целевых нуклеиновых кислот небольшие, к смеси может быть добавлен инертный носитель (такой как гликоген) для того, чтобы увеличить эффективность преципитации.
Другие методы осаждения нуклеиновых кислот включает селективную преципитацию с использованием высоких концентраций солей (“высаливание”), либо осаждение белков с использованием переменного рН.
Центрифугирование для удаления денатурированных белков и фрагментов клеточных органелл. Проводиться при 1500 rpm в течение 15 мин.
Осаждение ДНК из раствора возможно с помощью этанола: 96% этанол; изопропанол; очистка 70% этанолом; который считается наиболее часто используемым методом концентрирования ДНК. Растворив полученный осадок в меньшем объеме буферного раствора, получают более концентрированный раствор ДНК. При переосаждении ДНК спиртом происходит ее дополнительная очистка. Этиловый спирт как водоотнимающее средство снижает растворимость нуклеиновых кислот (их солей) в воде. ДНК агрегирует в 70% этаноле в присутствии соли, нейтрализующей фосфатные группы.
Другие методы осаждения нуклеиновых кислот включает селективную преципитацию с использованием высоких концентраций солей (“высаливание”), либо осаждение белков с использованием переменного рН.
Центрифугирование для удаления денатурированных белков и фрагментов клеточных органелл. Проводиться при 1500 rpm в течение 15 мин.
Осаждение ДНК из раствора возможно с помощью этанола: 96% этанол; изопропанол; очистка 70% этанолом; который считается наиболее часто используемым методом концентрирования ДНК. Растворив полученный осадок в меньшем объеме буферного раствора, получают более концентрированный раствор ДНК. При переосаждении ДНК спиртом происходит ее дополнительная очистка. Этиловый спирт как водоотнимающее средство снижает растворимость нуклеиновых кислот (их солей) в воде. ДНК агрегирует в 70% этаноле в присутствии соли, нейтрализующей фосфатные группы.
Преимущества метода
- получение ДНК хорошего качества;
- ДНК в конечном буфере высокой концентрации;
- выделенная ДНК очень стабильна;
- выделенная ДНК хорошо хранится в замороженном состоянии.
Недостатки метода
- высокая токсичность
- занимает много времени
- не всегда удаляет ингибиторы
- трудность автоматизации
Метод экстракции ДНК с помощью пластинки FTA
В основе метода пластинок FTA лежит целлюлозный фильтр (Ватман BFC180)
пропитанный смесью сильных буферов, которые содержат реактивы лизирующие клетки, денатурирующие белки и защищающие нуклеиновые кислоты от воздействия нуклеаз, окисления и повреждения ультрафиолетовыми лучами. Пластинки FTA быстро инактивируют микроорганизмы, включая возбудителей, передающихся через кровь. Препятствуют росту бактерий и других микроор-ганизмов. Клеточные мембраны и органеллы лизируют-ся, а высвобожденные нуклеиновые кислоты удержи-ваются волокнами пластинки. Нуклеиновые кислоты остаются фиксированными и стабильными; их можно перевозить, анализировать сразу или хранить при ком-натной температуре в течение длительного времени. Так как фиксированные нуклеиновые кислоты остаются стабильными, пластинки FTA удобно использовать для отбора проб на большом расстоянии от лаборатории и их транспортировки.
пропитанный смесью сильных буферов, которые содержат реактивы лизирующие клетки, денатурирующие белки и защищающие нуклеиновые кислоты от воздействия нуклеаз, окисления и повреждения ультрафиолетовыми лучами. Пластинки FTA быстро инактивируют микроорганизмы, включая возбудителей, передающихся через кровь. Препятствуют росту бактерий и других микроор-ганизмов. Клеточные мембраны и органеллы лизируют-ся, а высвобожденные нуклеиновые кислоты удержи-ваются волокнами пластинки. Нуклеиновые кислоты остаются фиксированными и стабильными; их можно перевозить, анализировать сразу или хранить при ком-натной температуре в течение длительного времени. Так как фиксированные нуклеиновые кислоты остаются стабильными, пластинки FTA удобно использовать для отбора проб на большом расстоянии от лаборатории и их транспортировки.
Преимущества метода
- безопасное обращение с образцами
- быстрое выделение высококачественного образца ДНК
- длительное хранение образца при комнатной температуре
Недостатки метода
- повышенная стоимость реактивов
- пригодность только для образцов жидкого типа
- количество ДНК, имеющееся на перфорате, невозможно подвергнуть количественному анализу или скорректировать
Метод экстракции с помощью магнитных частиц
Магнитные шарики простой и надежный способ очистки геномной ДНК. В оптимальных условиях, ДНК избирательно связывается с поверхностью магнитных гранул, в то время как другие составляющие клетки остаются в растворе. Очищенную ДНК затем можно использовать непосредственно в исследовании.
Основным преимуществом этого метода является то, что нет необходимости в центрифугирования. Экстракции кремниевым шариком (другой способ твердофазной экстракции) завоевали популярность в клинических исследованиях, и представляют собой сочетание магнитных технологий с покрытием кремнезема. При помощи этого метода белки и составляющие клеток удаляются, и остается очищенная ДНК. ДНК связывается с кремнеземом под действием высококонцентрированной соли.
Основным преимуществом этого метода является то, что нет необходимости в центрифугирования. Экстракции кремниевым шариком (другой способ твердофазной экстракции) завоевали популярность в клинических исследованиях, и представляют собой сочетание магнитных технологий с покрытием кремнезема. При помощи этого метода белки и составляющие клеток удаляются, и остается очищенная ДНК. ДНК связывается с кремнеземом под действием высококонцентрированной соли.
Преимущества метода
- большая емкость сорбента, позволяющая выделять большие количества ДНК/РНК;
- минимизация потерь в ходе выделения ДНК;
- уменьшение риска перекрестной контаминации за счет того, что весь нуклеиновый материал связывается с сорбентом;
- высокая чистота конечного продукта.
Недостатки метода
- дороговизна
Экстракция с помощью силики
К клеточному экстракту добавляется гуанидинтиоцианат, который денатурируют все компоненты клетки за исключением ДНК. ДНК связывается с частицами силики и далее элюируется в раствор.
Метод колоночного выделения использует то же свойство нуклеиновых кислот адгезироваться на поверхности материала silica в присутствии хаотропных ионов, и легко смываться в их отсутствии. Данный метод пришел из органической химии, где на первых этапах набивались стеклянные колонки различными материалами, в том числе silica, потом ДНК и РНК смывались, и далее колонка разбиралась и набивалась заново. Чтобы исключить эти трудоемкие этапы, было предложено использовать одноразовые пластиковые колонки, уже с прослойкой silica-мембраны, которые идеально подходят по размеру к обычным пробиркам эппендорф на 1,5 и 2 мл. Спин-колонки сконструированы таким образом, что при нанесении клеточного лизата на колонку и последующем центрифугировании ДНК остаётся на колонке, а всё лишнее проходит сквозь неё. Затем ДНК промывают несколько раз и элюируют в пробирку для сбора образца.
Метод колоночного выделения использует то же свойство нуклеиновых кислот адгезироваться на поверхности материала silica в присутствии хаотропных ионов, и легко смываться в их отсутствии. Данный метод пришел из органической химии, где на первых этапах набивались стеклянные колонки различными материалами, в том числе silica, потом ДНК и РНК смывались, и далее колонка разбиралась и набивалась заново. Чтобы исключить эти трудоемкие этапы, было предложено использовать одноразовые пластиковые колонки, уже с прослойкой silica-мембраны, которые идеально подходят по размеру к обычным пробиркам эппендорф на 1,5 и 2 мл. Спин-колонки сконструированы таким образом, что при нанесении клеточного лизата на колонку и последующем центрифугировании ДНК остаётся на колонке, а всё лишнее проходит сквозь неё. Затем ДНК промывают несколько раз и элюируют в пробирку для сбора образца.
Преимущества метода
- быстрота выполнения,
- простота в использовании,
- исключаются примеси ингибиторов;
- есть возможность автоматизации метода.
Недостатки метода
- сложность в выделении ДНК из объектов с малым количеством биологического материала
Спиртовое осаждение нуклеиновых кислот
После осаждения спиртом нуклеиновые кислоты отделяется от раствора центрифугированием. Осадок, содержащий целевую НК, отмывается 70% этиловым спиртом с последующим центрифугированием. После удаления супернатанта осадок подсушивается и растворяется в водном буфере. Роль соли в протоколе экстракции состоит в том, что её положительно заряженные ионы нейтрализуют отрицательный заряд на сахаро-фосфатном скелете НК, приводя к снижению растворимости последних в воде.
При выделении малых количеств НК (менее 100 нг) для визуализации осадка и улучшения процесса преципитации рекомендуется использовать соосадители, такие как гликоген, линейный полиакриломид или декстран. На предпоследнем этапе выделения ДНК проводится добавление 70% этанола для отмывки осадка от остатков солей. Важно, чтобы отмывка проводилась именно водным раствором спирта, так как соли хорошо растворяются в воде и в гораздо меньшей степени в спирте. Кроме того, использование 70% этанола препятствует переходу НК в водную фазу.
На завершающем этапе процедуры происходит растворение НК в водном буфере обычно при температуре 56-65°С и вортексировании, что необходимо для лучшего растворения осадка.
При выделении малых количеств НК (менее 100 нг) для визуализации осадка и улучшения процесса преципитации рекомендуется использовать соосадители, такие как гликоген, линейный полиакриломид или декстран. На предпоследнем этапе выделения ДНК проводится добавление 70% этанола для отмывки осадка от остатков солей. Важно, чтобы отмывка проводилась именно водным раствором спирта, так как соли хорошо растворяются в воде и в гораздо меньшей степени в спирте. Кроме того, использование 70% этанола препятствует переходу НК в водную фазу.
На завершающем этапе процедуры происходит растворение НК в водном буфере обычно при температуре 56-65°С и вортексировании, что необходимо для лучшего растворения осадка.
Преимущества метода
- полученная ДНК хорошего качества
- выделенная ДНК стабильная
- выделенная ДНК может хранится в замороженном состоянии
Недостатки метода
- длительность процедуры
- трудность автоматизации
- преципитат (осадок) иногда может визуально плохо определятся,что вызывает затруднение при удалении надосадочной жидкости
Обратная транскрипция и ПЦР
ОТ-ПЦР в реальном времени — это основанный на ядерных технологиях метод, который позволяет выявить присутствие определенного генетического материала любого патогена, чаще всего РНК вируса.
Вирус — это микроскопическая совокупность генетического материала, окруженного молекулярной оболочкой. Генетический материал может быть представлен либо дезоксирибонуклеиновой кислотой (ДНК), либо рибонуклеиновой кислотой (РНК).
Некоторые вирусы, такие как коронавирус SARS-CoV-2, вызывающий заболевание COVID19, содержат только РНК, что означает, что для размножения и выживания они должны проникать в здоровые клетки. Оказавшись внутри клетки, вирус использует свой собственный генетический код (РНК в случае вируса COVID-19), чтобы взять под контроль и «перепрограммировать» клетки так, чтобы они стали фабриками по производству вирусов
Для того чтобы при помощи ОТ-ПЦР в реальном времени выявить на раннем этапе присутствие в организме такого вируса, как COVID-19, необходимо преобразовать РНК в ДНК. Этот процесс называется «обратной транскрипцией». Это делается потому, что только ДНК можно копировать (или амплифицировать), что и является ключевой частью исследования методом ОТПЦР в реальном времени, применяемого для выявления вирусов.
Из тех частей тела, где скапливается вирус COVID-19, например из носа или горла человека, берется образец для проведения исследования. Образец обрабатывают несколькими химическими растворами, которые удаляют такие вещества, как белки и жиры, и извлекают только присутствующую в нем РНК. Эта извлеченная РНК представляет собой смесь собственного генетического материала человека и РНК вируса, если она присутствует в образце.
C помощью определенного фермента производится обратная транскрипция РНК для синтеза ДНК. Затем добавляют дополнительные короткие фрагменты ДНК, которые комплементарны определенным частям транскрибированной вирусной ДНК. Если в образце присутствует вирус, эти фрагменты прикрепляются к заданным участкам вирусной ДНК. Некоторые из добавленных генетических фрагментов предназначены для построения цепей ДНК во время амплификации, в то время как другие предназначены для построения ДНК и добавления к этим цепям маркерных меток, которые затем используются для выявления вируса.
После этого смесь помещается в прибор для проведения ОТ-ПЦР. Прибор выполняет циклы изменения температуры, во время которых смесь нагревается и охлаждается для того, чтобы запустить определенные химические реакции, которые создают новые точные копии заданных участков вирусной ДНК. Цикл многократно повторяется, чтобы продолжить копирование заданных участков вирусной ДНК. После каждого цикла происходит удвоение количества по сравнению с предыдущим: две копии превращаются в четыре, четыре — в восемь и так далее. Обычно при проведении ОТ-ПЦР в реальном времени выполняется 35 циклов; это означает, что к концу процесса из каждой цепи вируса, присутствующей в образце, создается около 35 миллиардов новых копий участков вирусной ДНК.
По мере того как создаются новые копии вирусных участков ДНК, маркерные метки прикрепляются к цепям ДНК, а затем высвобождают флуоресцентный краситель, уровень которого измеряется вычислительным устройством прибора с выводом показателя в режиме реального времени на экран. Вычислительное устройство отслеживает уровень флуоресцентного сигнала в образце после каждого цикла. Превышение определенного уровня флуоресценции служит подтверждением присутствия вируса. Ученые также смотрят, сколько циклов требуется для достижения этого уровня для того, чтобы оценить тяжесть инфекции: чем меньше циклов, тем тяжелее вирусная инфекция.
