Практическое занятие 5
Галымжан Сейтгалиев
Требования к планировке
ПЦР-исследования лучше проводить в лаборатории, размещенной в отдельно стоящем здании или изолированной его части. Если такая возможность отсутствует, тогда можно оборудовать специальный блок на базе действующей лаборатории при условии организации в ней самостоятельных рабочих зон, соответствующих этапам проведения исследований, поточности движения персонала и материалов, содержащих патогенные биологические агенты.
Помещения, в которых выполняется ПЦР-диагностика, должны быть разделены на боксы, промаркированы и пронумерованы соответствующим образом.
В соответствии с этапами выполнения ПЦР-диагностики необходимо выделить следующий набор помещений или рабочих зон:
Рабочая зона 1
Здесь проводится прием материала, его маркировка и регистрация, первичная подготовка, объединение или разделение проб на аликвоты, хранение проб, обеззараживание остатков исследуемого материала. Здесь же допускаются также прием, регистрация, разбор и первичная обработки материала, исследуемого при помощи других методов лабораторной диагностики, например, бактериологических, вирусологических, иммунологических.
Рабочая зона 2
Необходима для выделения и очистки нуклеиновых кислот микроорганизмов. Рабочая зона 3. Служит для приготовления реакционных смесей, проведения обратной транскрипции, амплификации нуклеиновых кислот и учета результатов амплификации при использовании гибридизационно-флуоресцентного метода детекции.
Рабочая зона 3
рекомендуется поделить на две подзоны – 3а и 3б, которые размещают в отдельных помещениях. В первой подзоне готовят реакционные смеси и проводят обратную транскрипцию, во второй – остальные перечисленные выше манипуляции.
Рабочая зона 4-1
Предназначена для учета результатов продуктов амплификации нуклеиновых кислот методом электрофореза или гибридизационно-ферментным методом детекции, а также очистки продуктов амплификации для секвенирования.
Рабочая зона 4-2
Необходима для детекции продуктов амплификации нуклеиновых кислот методом секвенирования или на ДНК-чипах. При использовании различных методов учета результатов продуктов амплификации нуклеиновых кислот внутри рабочих зон 4-1 и 4-2 выделяют отдельные подзоны или отдельные боксированные помещения для каждого типа детекции. Объединение рабочих зон 4-1 и 4-2 строго запрещено. Рабочие зоны 4-1 и 4-2 должны быть изолированы от остальных помещений «заразной» зоны для предотвращения контаминации продуктами амплификации через воздушный поток.
В «заразной» зоне должна быть предусмотрена автоклавная, оснащенная необходимым оборудованием для обеззараживания исследуемого материала. Она может быть общей с подразделениями лаборатории, выполняющими иные виды исследований, при условии соблюдения требований биологической безопасности. В составе самостоятельной ПЦР-лаборатории, помимо рабочих зон, необходимо выделить «чистую» зону, куда могут быть включены комнаты отдыха и приема пищи для персонала, ординаторские, кабинет заведующего, раздевалки для сотрудников, туалет, душевая, складские помещения.
Требования к отделке и оборудованию
Пол и стены в помещениях ПЦР-лаборатории облицовывают кафелем. Потолок, а при необходимости и стены, красят, используя материалы, не изменяющие своих свойств при обработке моющими и дезинфицирующими средствами. Все внутренние поверхности, лабораторная мебель и оборудование должны быть гладкими, не иметь трещин или щелей, устойчивыми к ультрафиолетовому излучению, влажной уборке и обработке дезинфектантами.
Для передачи исследуемого материала в рабочие зоны 1, 2 и 3 желательно предусмотреть шлюзовые передаточные окна, а в рабочие зоны 4-1 и 4-2 – передаточные окна без шлюзовой системы.
Окна должны иметь надежные запирающие устройства. Допускается использование светозащитных пленок из материалов, устойчивых к дезинфектантам. Установка жалюзи запрещена из-за адсорбции ими пыли. Все рабочие помещения должны иметь водопровод, канализацию, электричество и отопление, естественное и искусственное освещение, приточно-вытяжную вентиляцию, а также иметь средства пожаротушения. В рабочей зоне 3 объем приточного воздуха должен соответствовать объему на вытяжке, а в рабочих зонах 1 и 2 вытяжка должна преобладать над притоком. Зоны 4-1 и 4-2 целесообразно оснастить автономной системой приточно-вытяжной вентиляции, при этом вытяжка должна преобладать над притоком. В помещениях рабочих зон можно устанавливать кондиционеры, но при условии их выключения на время проведения работ с использованием методов амплификации нуклеиновых кислот и последующей дезинфекции рабочих мест, ежемесячной дезинфекции и замены фильтров.
Окна должны иметь надежные запирающие устройства. Допускается использование светозащитных пленок из материалов, устойчивых к дезинфектантам. Установка жалюзи запрещена из-за адсорбции ими пыли. Все рабочие помещения должны иметь водопровод, канализацию, электричество и отопление, естественное и искусственное освещение, приточно-вытяжную вентиляцию, а также иметь средства пожаротушения. В рабочей зоне 3 объем приточного воздуха должен соответствовать объему на вытяжке, а в рабочих зонах 1 и 2 вытяжка должна преобладать над притоком. Зоны 4-1 и 4-2 целесообразно оснастить автономной системой приточно-вытяжной вентиляции, при этом вытяжка должна преобладать над притоком. В помещениях рабочих зон можно устанавливать кондиционеры, но при условии их выключения на время проведения работ с использованием методов амплификации нуклеиновых кислот и последующей дезинфекции рабочих мест, ежемесячной дезинфекции и замены фильтров.
В «заразной» зоне следует предусмотреть наличие ультрафиолетовых бактерицидных облучателей. Каждая самостоятельная рабочая зона должна быть оснащена необходимым набором соответствующего лабораторного оборудования, которое выбирают с учетом используемых методов диагностики, в том числе боксами биологической безопасности. При подключении амплификационного оборудования рекомендуется использовать источники бесперебойного питания. Комплекты мебели, пластиковой и стеклянной посуды, расходных материалов, защитной одежды и уборочного инвентаря запрещено переносить из одной зоны в другую. Чтобы соблюсти требования санитарных правил, на них наносят маркировку с указанием принадлежности к тому или иному помещению.
Используемое в работе оборудование должно быть зарегистрировано в установленном порядке, иметь технический паспорт и рабочую инструкцию по эксплуатации на русском языке, соответствовать нормам безопасности и электромагнитной совместимости. Не реже 1 раза в год поверяют все измерительные приборы.
Безопасные условия выполнения работ
Транспортировку материала, подлежащего исследованию, осуществляют в плотно закрывающихся контейнерах или сумках-холодильниках, выдерживающих дезинфекционную обработку. На дно контейнера укладывают адсорбирующий материал, например, марлю или вату, смоченную дезинфицирующим раствором. В зависимости от вида исследуемого материала, используемой транспортной среды и температурного режима сроки хранения и транспортировки материала могут значительно варьироваться.
При проведении ПЦР-исследований должна строго соблюдаться поточность движения исследуемого материала, проб нуклеиновых кислот, продуктов амплификации. После регистрации, разбора и первичной обработки поступающий на исследование материал подлежит обязательному обеззараживанию в рабочей зоне 1. Его передача в рабочую зону 2 возможна только в закрытых маркированных одноразовых микроцентрифужных пробирках объемом 1,5–2,0 мл. Перенос проб из одной зоны в другую, а также их хранение рекомендуется осуществлять в плотно закрывающихся металлических или пластмассовых контейнерах с их последующей обработкой регламентируемыми дезинфицирующими средствами после каждого использования.
В рабочих зонах 1 и 2 все манипуляции с материалами, которые могут содержать патогенные биологические агенты, включая процедуры с риском образования аэрозолей, выполняют в боксах биологической безопасности II или III классов. В зонах 3, 4-1 и 4-2 используют боксы биологической безопасности II и I классов защиты либо ПЦР-боксы. При работе с материалом, содержащим микроорганизмы III–IV групп патогенности, этапы анализа, выполняемые в рабочих зонах 4-1 и 4-2, проводят на лабораторных столах.
По завершении каждой манипуляции на этапах исследования необходимо сменить наконечники для автоматических пипеток. Расходные материалы и наборы реагентов должны в строгости соответствовать имеющемуся лабораторному оборудованию.
После окончания работ все материалы, которые могут содержать патогенные биологические агенты, помещают на хранение в холодильное или морозильное оборудование на время проведения исследований. Условия хранения наборов реагентов и образцов проб должны соответствовать инструкциям по применению. Образцы проб, содержащих нуклеиновые кислоты или ампликоны, хранят в разных холодильниках с реагентами.
После окончания работ все материалы, которые могут содержать патогенные биологические агенты, помещают на хранение в холодильное или морозильное оборудование на время проведения исследований. Условия хранения наборов реагентов и образцов проб должны соответствовать инструкциям по применению. Образцы проб, содержащих нуклеиновые кислоты или ампликоны, хранят в разных холодильниках с реагентами.
Дезинфекционные мероприятия
- Перед тем как приступить к выполнению работ, поверхности столов, биологических боксов и оборудования обрабатывают 70% этиловым спиртом.
- После завершения работ поверхности также подвергают дезинфекции. Воздух в «заразной» зоне обеззараживают при помощи ультрафиолетовых бактерицидных облучателей в соответствии с утвержденным графиком.
- Ежедневно в конце рабочего дня проводят влажную уборку с использованием разрешенных к применению дезинфекционных средств.
- Генеральную уборку в боксированных помещениях выполняют не реже 1 раза в неделю.
- Каждая рабочая зона лаборатории должна быть обеспечена промаркированным набором уборочного инвентаря, который используется строго по назначению.
- Остатки материала, который может содержать патогенные биологические агенты, использованную лабораторную посуду подвергают автоклавированию.
- Не допускается слив необеззараженных жидкостей в канализационную сеть. Внутрилабораторный контроль качества дезинфекции и деконтаминации ампликонов проводят путем исследования смывов с поверхностей оборудования и помещений.
Требования к персоналу и охране труда
ПЦР-исследования осуществляют специалисты с высшим и средним медицинским или биологическим образованием, прошедшие обучение на курсах повышения квалификации по молекулярнобиологическим методам диагностики. При приеме на работу, а затем ежегодно специалистов направляют на медицинский осмотр с целью выявить противопоказания с учетом специфики трудовой деятельности и ранней диагностики профессиональной патологии. Допуск персонала к работам осуществляется на основании приказа руководителя медицинской организации. Не могут привлекаться к выполнению исследований лица, имеющие медицинские противопоказания к вакцинации, лечению специфическими препаратами, использованию средств индивидуальной защиты. Все сотрудники должны быть привиты в соответствии с календарем профилактических прививок и календарем прививок по эпидемическим показаниям.
При приеме на работу, а затем не реже двух раз в год сотрудники ПЦР-лабораторий проходят инструктаж по соблюдению требований биологической безопасности и охраны труда. Один раз в год осуществляется проверка знаний по охране труда. При изменении характера технологических процессов проводят внеплановый и целевой инструктажи.
При приеме на работу, а затем не реже двух раз в год сотрудники ПЦР-лабораторий проходят инструктаж по соблюдению требований биологической безопасности и охраны труда. Один раз в год осуществляется проверка знаний по охране труда. При изменении характера технологических процессов проводят внеплановый и целевой инструктажи.
Каждая рабочая зона обеспечивается необходимым количеством комплектов спецодежды, включающих комбинезоны или пижамы, медицинские халаты, медицинскую обувь, шапочки, одноразовые медицинские перчатки, маски или респираторы. При работе в помещении детекции продуктов амплификации дополнительно надевают одноразовые бахилы. Предпочтительно использовать одноразовую спецодежду. Средства индивидуальной защиты одевают или снимают в предбоксах, в каждом из которых должен быть отдельный комплект защитной одежды и обуви.
На случай аварийных ситуаций в лаборатории должен быть разработан план ликвидации аварии и сформирован запас дезинфицирующих средств. Кроме того, в специально отведенном месте хранят аварийную аптечку, гидропульт, комплекты рабочей одежды для переодевания пострадавших и защитной одежды для сотрудников, ликвидирующих последствия аварии. Ответственный за комплектование аптечки и аварийной укладки – заведующий лабораторией.
На случай аварийных ситуаций в лаборатории должен быть разработан план ликвидации аварии и сформирован запас дезинфицирующих средств. Кроме того, в специально отведенном месте хранят аварийную аптечку, гидропульт, комплекты рабочей одежды для переодевания пострадавших и защитной одежды для сотрудников, ликвидирующих последствия аварии. Ответственный за комплектование аптечки и аварийной укладки – заведующий лабораторией.
Проблемы преаналитического этапа
К трудностям преаналитического этапа следует отнести необходимость правильного выполнения процедуры сбора и маркировки образцов биологического материала, их обработки, транспортировки и хранения, а также тестирование пациентов, получающих антиретровирусную терапию. Все эти обстоятельства влияют на результаты исследования.
Выбор биологического материала для исследования
Анализ зарубежных данных показывает, что чувствительность исследования при выявлении РНК вируса в мазках из носоглотки/ротоглотки различно. Отмечены случаи выявления вируса в третьем образце после двух отрицательных в предыдущих исследованиях.
Согласно проведенным исследованиям, процент выявления вируса в различных биологических материалах различен. При сходных клинических проявлениях заболевания в более 90% случаев положительный результат выявления РНК получали в образцах бронхоальвеолярной жидкости (БАЛ). На втором месте по выявляемости вируса – образцы мокроты, а за ними следуют мазки из носоглотки.
Случаи, когда исследования для обнаружения вируса в мазках из носоглотки/ротоглотки, одномоментно взятых у пациента, дают и положительные, и отрицательные результаты – проблема не только отечественных лабораторий. Если в паре таких взятых одновременно мазков получены противоположные результаты, чаще вирус обнаруживается в мазках из носоглотки. Причины этого дискутабельны. В качестве одной из версий рассматривают более низкую концентрацию вируса в таком образце.
Согласно проведенным исследованиям, процент выявления вируса в различных биологических материалах различен. При сходных клинических проявлениях заболевания в более 90% случаев положительный результат выявления РНК получали в образцах бронхоальвеолярной жидкости (БАЛ). На втором месте по выявляемости вируса – образцы мокроты, а за ними следуют мазки из носоглотки.
Случаи, когда исследования для обнаружения вируса в мазках из носоглотки/ротоглотки, одномоментно взятых у пациента, дают и положительные, и отрицательные результаты – проблема не только отечественных лабораторий. Если в паре таких взятых одновременно мазков получены противоположные результаты, чаще вирус обнаруживается в мазках из носоглотки. Причины этого дискутабельны. В качестве одной из версий рассматривают более низкую концентрацию вируса в таком образце.
Ошибки при подготовке к процедуре сбора образцов
Важно уведомить пациентов о правилах подготовки к исследованию. Сбор материала для культуральных исследований и микроскопии необходимо проводить до назначения специфической противомикробной терапии. Материал берут натощак или через 3–4 часа после еды. Перед исследованием пациенту не рекомендуется пить, чистить зубы, полоскать ротовую полость, курить. Но на практике пациенты часто не осведомлены о таких важных требованиях. Как следствие – ложноотрицательные результаты обнаружения РНК вируса. Исключить подобные ошибки помогут памятки для пациентов (образец в приложении).
Ошибки в ходе процедуры сбора образцов
Забор проб биологического материала для выявления РНК нового коронавируса (SARS-CoV-2) должен производиться в определенном объеме и последовательности
1) Мазки берут сухими стерильными зондами.
2) Зонд вводят легким движением ПО НАРУЖНОЙ СТЕНКЕ полости носа на глубину 2–3 см до нижней носовой раковины.
3) Затем зонд слегка опускают книзу, вводят в нижний носовой ход под нижнюю носовую раковину и удаляют вдоль НАРУЖНОЙ СТЕНКИ полости носа, производя вращательные движения (3–4 см у детей и 5–6 см у взрослых).
4) Конец зонда отламывают с расчетом, чтобы он позволил плотно закрыть крышку пробирки.
5) Пробирку с раствором и рабочей частью зонда закрывают. Нельзя обрезать зонды ножницами.
1) Мазки берут сухими стерильными зондами.
2) Зонд вводят легким движением ПО НАРУЖНОЙ СТЕНКЕ полости носа на глубину 2–3 см до нижней носовой раковины.
3) Затем зонд слегка опускают книзу, вводят в нижний носовой ход под нижнюю носовую раковину и удаляют вдоль НАРУЖНОЙ СТЕНКИ полости носа, производя вращательные движения (3–4 см у детей и 5–6 см у взрослых).
4) Конец зонда отламывают с расчетом, чтобы он позволил плотно закрыть крышку пробирки.
5) Пробирку с раствором и рабочей частью зонда закрывают. Нельзя обрезать зонды ножницами.
Время сбора биоматериала.
Концентрация вируса в организме меняется в зависимости от времени, прошедшего после появления первых симптомов у пациента, следовательно, 28 ПЦР-тестирование на COVID-19: как организовать и оптимизировать исследования диагностическая чувствительность выявления РНК вируса методом ПЦР зависит от времени взятия образца на исследование. По данным, озвученным 29.05.2020 года на вебинаре Федерации лабораторной медицины, посвященном проблемам диагностики новой коронавирусной инфекции, в период с 1-го по 7-й день после появления симптомов диагностическая чувствительность исследования составляет 66,7%, с 8-го по 14-й – 54%, с 15-го по 39-й – 45,5%.
Качество расходных материалов
Известно, что для проведения ПЦР-диагностики выделения нуклеиновых кислот необходимы специализированный сертифицированный пластик, расходные материалы (пластик), свободные от РНКаз и ДНКаз. Поскольку такие изделия преимущественно поставляются из-за рубежа, отечественные лаборатории в настоящее время могут испытывают дефицит таких материалов.
Сбор биоматериала из носоглотки должен производиться с помощью специализированного зонда с мягкой частью, важно также использовать ворсистый зонд, который забирает больше материала и легко отдает его в транспортную среду.
Сбор биоматериала из носоглотки должен производиться с помощью специализированного зонда с мягкой частью, важно также использовать ворсистый зонд, который забирает больше материала и легко отдает его в транспортную среду.
Транспортировка и хранение образцов биоматериала
К причинам, которые могут повлиять на результат исследования, однозначно относится и качество транспортной
Внимание Два или более образца одного пациента могут быть упакованы в один пластиковый пакет. Запрещается собирать образцы биологического материала разных пациентов в одну упаковку.
ПЦР-тестирование: как организовать и оптимизировать исследования среды, а точнее – сроки и температурный режим транспортировки и хранения биоматериала в транспортном растворе. Наборы разных производителей рекомендуют различные варианты температурных режимов для хранения и транспортировки образцов, предлагают различные объемы контейнера для сбора образцов и объема транспортной среды в них. Перед взятием образцов необходимо согласовать состав транспортной среды и сроки доставки образцов с лабораторией, в которой предполагается выполнение исследований.
Транспортировка и хранение образцов биоматериала должны осуществляться с соблюдением требований СП 1.2.036-95 «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I–IV групп патогенности», (см. таблицу 1). Это правило часто нарушается, образцы перевозят при комнатной температуре или температуре окружающей среды.
Внимание Два или более образца одного пациента могут быть упакованы в один пластиковый пакет. Запрещается собирать образцы биологического материала разных пациентов в одну упаковку.
ПЦР-тестирование: как организовать и оптимизировать исследования среды, а точнее – сроки и температурный режим транспортировки и хранения биоматериала в транспортном растворе. Наборы разных производителей рекомендуют различные варианты температурных режимов для хранения и транспортировки образцов, предлагают различные объемы контейнера для сбора образцов и объема транспортной среды в них. Перед взятием образцов необходимо согласовать состав транспортной среды и сроки доставки образцов с лабораторией, в которой предполагается выполнение исследований.
Транспортировка и хранение образцов биоматериала должны осуществляться с соблюдением требований СП 1.2.036-95 «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I–IV групп патогенности», (см. таблицу 1). Это правило часто нарушается, образцы перевозят при комнатной температуре или температуре окружающей среды.
Сбор, хранение и транспортировка биологического материала
Учитывая, что этиологическая диагностика вируса проводится не в каждом медицинском учреждении, напоминаем требования к направлению на исследование для этиологической диагностики COVID-19: оно оформляется в электронном виде (через систему удаленной электронной регистрации или в виде электронного заказа в программе МИС врачом-клиницистом) или на бумажном носителе.
Направление на исследование для этиологической диагностики COVID-19 должно содержать:
- персональные данные пациента, обеспечивающие его однозначную идентификацию
- наименование направившего биоматериал отделения (организации)
- предварительный диагноз заболевания: «пневмония» или «ОРВИ» или «обследование контактировавших лиц на COVID-19
- указание вида биологического материала
- дата и время назначения лабораторного исследования
- дата и время взятия материала
- Ф. И. О. и должности врача либо другого уполномоченного представителя, назначившего лабораторное исследование
- Ф.И. О. медицинского работника, осуществившего взятие биоматериала.
При направлении образцов биологического материала для исследования в лабораторию другой медицинской организации помимо сведений, перечисленных выше, должно быть указано наименование ЛПУ, в которое должен поступить материал.
Проблемы аналитического этапа
Организация исследования
Понимая ответственность и важность диагностики в условиях пандемии, лаборатория не должна пренебрегать правилами планировки помещений и организации работы в ПЦР-отделении согласно нормативным документам.
Внимание Если контрольные образцы не входят в состав используемого набора реагентов, необходимо использовать совместимые контроли (наборы реагентов для контроля эффективности выделения нуклеиновых кислот и отсутствия ингибиторов ПЦР).
Это важно и с точки зрения безопасности персонала, и с точки зрения достоверности исследований. Исследование материала, содержащего (подозрительного на содержание) микроорганизмы I–IV групп патогенности, МАНК осуществляют специалисты с высшим или средним медицинским или биологическим (ветеринарным) образованием, прошедшие подготовку на лицензированных курсах первичной специализации по работе с микроорганизмами I–II групп патогенности (опасности) (только при работе с данными микроорганизмами) или с микроорганизмами III–IV групп патогенности, получившие дополнительное специальное образование на курсах повышения квалификации по молекулярно-биологическим методам диагностики. Допуск персонала к работе в лаборатории осуществляется в порядке, регламентированном действующими санитарными правилами проведения работ с микроорганизмами I–IV групп патогенности. Наборы реагентов и оборудования должны иметь все необходимые разрешительные документы.
Желательно организовать автоматизацию ключевых процессов – автоматическое выделение нуклеиновых кислот предпочтительнее ручного. Такой формат работы важен для обеспечения безопасности сотрудников и позволяет избежать перекрестной контаминации.
Внимание Если контрольные образцы не входят в состав используемого набора реагентов, необходимо использовать совместимые контроли (наборы реагентов для контроля эффективности выделения нуклеиновых кислот и отсутствия ингибиторов ПЦР).
Это важно и с точки зрения безопасности персонала, и с точки зрения достоверности исследований. Исследование материала, содержащего (подозрительного на содержание) микроорганизмы I–IV групп патогенности, МАНК осуществляют специалисты с высшим или средним медицинским или биологическим (ветеринарным) образованием, прошедшие подготовку на лицензированных курсах первичной специализации по работе с микроорганизмами I–II групп патогенности (опасности) (только при работе с данными микроорганизмами) или с микроорганизмами III–IV групп патогенности, получившие дополнительное специальное образование на курсах повышения квалификации по молекулярно-биологическим методам диагностики. Допуск персонала к работе в лаборатории осуществляется в порядке, регламентированном действующими санитарными правилами проведения работ с микроорганизмами I–IV групп патогенности. Наборы реагентов и оборудования должны иметь все необходимые разрешительные документы.
Желательно организовать автоматизацию ключевых процессов – автоматическое выделение нуклеиновых кислот предпочтительнее ручного. Такой формат работы важен для обеспечения безопасности сотрудников и позволяет избежать перекрестной контаминации.
Применение контрольных образцов
К неправильному (ложноположительному или ложноотрицательному) результату на аналитическом этапе исследования могут привести перекрестная контаминация и разрушение РНК. В процессе выделения нуклеиновых кислот контаминация может иметь место между реагентами, используемыми при выделении НК, и реагентами зоны выделения. От ошибок на данном этапе страхует применение контрольных образцов: внутренний, положительный и отрицательный. Применение контрольных образцов обязательно, однако, к сожалению, не все диагностические наборы укомплектованы ими.
Внимание Необходимо проводить валидацию каждой серии, используя контрольные образцы.
ПЦР-тестирование на COVID-19: как организовать и оптимизировать исследования
Внимание Необходимо проводить валидацию каждой серии, используя контрольные образцы.
ПЦР-тестирование на COVID-19: как организовать и оптимизировать исследования
Особенности постаналитического этапа исследований
Результаты ПЦР-исследования должны считаться достоверными, если получены правильные результаты для всех контрольных образцов на каждом этапе выделения РНК и на этапе амплификации
Интерпретация результатов исследования
Обязательное условие: при получении невалидного результата повторное исследование следует начать с этапа выделения РНК. При выдаче результата следует учитывать характеристики набора реагентов, указанные в инструкции (минимально определяемая концентрация, формат представления результатов и др.).
Внимание! При получении положительного или сомнительного результата при выявлении некоторых инфекций (например, РНК SARS-CoV-2 или другие опасные инфекции) необходимо проинформировать ближайший территориальный орган Комитета санитарно-эпидемического контроля в течение двух часов.
Внимание! При получении положительного или сомнительного результата при выявлении некоторых инфекций (например, РНК SARS-CoV-2 или другие опасные инфекции) необходимо проинформировать ближайший территориальный орган Комитета санитарно-эпидемического контроля в течение двух часов.
Ошибки при интерпретации результата
Говоря об ошибках при интерпретации результатов, имеет смысл рассмотреть различные способы детекции.
- При детекции с использованием гель-электрофореза есть риск принять неспецифические фрагменты за специфичные, если они близки по длине и нет возможности четко и однозначно сравнить положительным контролем и, в идеале, с маркером длин. Также, поскольку образцы часто наносятся на гель одним наконечником, существует риск контаминации уже на этапе детекции, если наконечник плохо промывался или одна из проб оказалась с очень высокой концентрацией ДНК. Такого рода контаминация легко отслеживается в случае, если полоса наблюдается в заведомо отрицательной пробе, однако она неотличима от контаминации в лаборатории и требует повторной проверки всех образцов.
- Одной из ошибок интерпретации, связанных с использованием метода флуоресцентной детекции по конечной точке, является невнимательное отношение к нормировочным значениям фоновых пробирок и к значениям флуоресценции в отрицательных пробах. Так, при неправильном хранении зонды в фоновых пробирках могут разрушаться, и нормировочные значения существенно увеличиваются за срок от нескольких часов о нескольких дней, при этом значения флуоресценции в образцах оказываются в большей или меньшей степени занижены. Главным критерием достоверности полученных результатов в данном случае могут служить отрицательные пробы. При отсутствии расхождений между фоновыми и амплификационными пробирками отрицательные образцы имеют значения флуоресценции близкие к единице или, в редких случаях, чуть выше. Если значения флуоресценции в одном или нескольких образцах или отрицательном контроле существенно ниже единицы, с большой долей вероятности можно утверждать, что фоновые пробирки не соответствуют данному исследованию, в этом случае необходимо их поменять.
- Наиболее частая ошибка при исследовании методом ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени связана с прибором, который при больших колебаниях флуоресценции может зафиксировать ложноположительные результаты. В связи с этим необходимо проводить анализ индивидуальной кривой. Пороговая линия должна пересекать индивидуальную кривую в области начала экспоненциального роста, и это не один из множества пиков колебания флуоресценции. Также прибор может выдать ложноотрицательный результат в случае, если на первых циклах ПЦР по каким-то причинам произошло существенное уменьшение флуоресценции. Эту ошибку можно обнаружить при анализе исходных кривых флуоресценции. Если образец положительный, то на исходной кривой будет виден четкий экспоненциальный рост. Для большей достоверности можно сравнить такую сомнительную кривую с кривой заведомо положительной. Все положительные кривые имеют сходный угол наклона и уровень флуоресценции при выходе на плато заметно отличается от колебаний в отрицательных образцах.
Ошибки постаналитического этапа ПЦР-диагностики
Ошибки на завершающем, постаналитическом этапе, связаны с неверной интерпретацией врачом результатов ПЦР-анализа вследствие ошибочных представлений об инфекционном агенте или о возможностях метода.
Например, контрольное исследование на хламидиоз через 1 неделю после окончания курса антибиотиков даст положительный результат. Врач сделает вывод о неэффективности проведенной терапии. Однако окончательный вывод можно сделать не ранее чем через 4–6 недель, после того как сменится эпителиальный слой, в котором паразитирует данный микроорганизм. Более ранняя диагностика может показать неверный результат, поскольку в клетках эпителия еще сохраняются погибшие микроорганизмы.
Важно учитывать специфичность используемых тест-систем. Так, например, пациент с предполагаемым диагнозом “респираторный хламидиоз” направляется на исследование. При постановке ПЦР используется видоспецифическая тест-система для выявления ДНК С. Trachomatis – результат исследования отрицательный. Однако врач не должен снимать предполагаемый диагноз, поскольку инфекция может быть вызвана другими видами хламидий, например С. pneumonia, C. pecorum, C. psitaci, которые не диагносцируются данной тест- системой. То есть при назначении ПЦР-исследования врач должен очень четко представлять границы специфичности применяемых тест-систем.
Вместе с тем не несовпадение результатов различных методов исследования не говорит об ошибке. Зачастую ПЦР-исследование дает положительный результат, в то время, как ИФА – отрицательный, либо наоборот. Несовпадение результатов исследований может объясняться, например, периодом “серологического окна”.
В случае обратных результатов исследований возможен “иммунологический след” – остаточный уровень антител, который у некоторых людей может сохраняться многие месяцы и даже годы после выздоровления, либо при проведении ПЦР не учитывается видоспецифичность тест-систем.
Приведенные примеры показывают, что необходима обратная связь между специалистами ПЦР-лаборатории и врачами-клиницистами, для осуществления точной диагностики в сложных случаях и выработки правильной стратегии лечения пациента.
Применение средств индивидуальной защиты
Наибольший риск заражения патогенами в условиях лаборатории создает, вероятно, воздействие образцов материала, взятых из верхних и нижних дыхательных путей при отсутствии надлежащих мер локализации и контроля. При исследовании в клинико-диагностической лаборатории ее сотрудники должны носить средства индивидуальной защиты (СИЗ). СИЗ и одежда выступают в роли барьера для минимизации риска воздействия аэрозолей, брызг и непреднамеренной инокуляции. Выбор одежды и снаряжения зависит от характера выполняемой работы. Необходимо снимать СИЗ при выходе из лаборатории и строго соблюдать правила гигиены, включая мытье рук.
Все лаборатории должны проводить оценку рисков для конкретных участков и видов деятельности с целью выявления и снижения рисков, а также соблюдать стандартные меры предосторожности при работе с клиническими образцами, в которых могут содержаться возбудители инфекции.
Все лаборатории должны проводить оценку рисков для конкретных участков и видов деятельности с целью выявления и снижения рисков, а также соблюдать стандартные меры предосторожности при работе с клиническими образцами, в которых могут содержаться возбудители инфекции.
В соответствии с рекомендациями ВОЗ, лаборанты, производящие выделение вируса из клинических образцов пациентов, потенциально инфицированных новым коронавирусом, должны соблюдать строгие правила. Такие исследования должны проводиться только в лабораториях, способных выполнить дополнительные требования по локализации инфекции, установленные ВОЗ, и работники лаборатории должны носить указанное ниже защитное снаряжение.
Комплект средств индивидуальной защиты в аналитической лаборатории при работе с возбудителями инфекционных заболеваний
Уровни биологической безопасности лабораторий
Лабораторные помещения классифицируются и обозначаются следующим образом:
Классификация лабораторий по уровням производится, исходя из их назначения, конструкции, средств локализации, используемого оборудования, технологической базы и оперативных процедур, необходимых для работы с агентами, относящимися к различным группам риска.
Связь между группами риска с уровнями биологической безопасности, технологиями и оборудованием.
Рекомендации по СИЗ для различных уровней биобезопасности лабораторий
Требования к защитной одежде
- Выбор типа защитного костюма проводится в строгом соответствии с СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I - II групп патогенности (опасности)» и определяется видом возбудителя, рабочей зоной ПЦР, оснащением ее боксами биологической безопасности.
- Прием и первичную обработку материала, доставленного на исследование (объединение или разделение проб, центрифугирование, инактивацию и т.д.), выполняют в защитном костюме I - II или IV типа, дополненном перчатками и, при необходимости, респиратором.
- В помещении подготовки проб и выделения НК при исследовании материала, инфицированного бактериями I - II групп, подвергнутыми инактивации на этапе подготовки проб, работу проводят в боксе биологической безопасности II класса в костюме IV типа, дополненном резиновыми перчатками.
- В связи с отсутствием регламентированных методов инактивации вирусов II группы работу с материалом, зараженным или подозрительным на зараженность возбудителями крымско-геморрагическая лихорадка, SARS CoV, геморрагическая лихорадка с почечным синдромом, омская геморрагическая лихорадка, проводят в боксе биологической безопасности III класса защиты в костюме IV типа и резиновых перчатках или в боксе биологической безопасности II класса в костюме I типа. Работу с другими вирусами II группы проводят в боксе биологической безопасности II класса в защитном костюме IV типа, дополненном резиновыми перчатками и респиратором.
- На этапах проведения ПЦР, учета результатов работу проводят в следующих видах защитной одежды:
-с пробами, инфицированными возбудителями крымско-геморрагическая лихорадка, SARS CoV, геморрагическая лихорадка с почечным синдромом, омская геморрагическая лихорадка - в костюме I типа или в боксе биологической безопасности II класса в костюме IV типа, дополненного резиновыми перчатками и респиратором. Работу с другими вирусами II группы проводят в защитном костюме IV типа, дополненном респиратором и резиновыми перчатками.
- В пост-ПЦР-помещении должны работать сотрудники, не занятые на этапах подготовки проб и постановки ПЦР, при входе в помещение надевают бахилы или сменную обувь.
- Надевание и снятие защитной одежды производят в предбоксах. В каждом из них должен быть отдельный комплект защитной одежды и обуви. Наиболее загрязненной продуктами амплификации считается защитная одежда зоны детекции и, в первую очередь, резиновые перчатки. Перед снятием одежды необходимо заменить перчатки на чистые.
- Обработку одежды из комнат подготовки проб, ПЦР-амплификации и учета результатов проводят раздельно.
