• Первой и самой существенной ошибкой преаналитического этапа ПЦР-диагностики является неправильный выбор места взятия биологического материала для исследования. Поскольку метод ПЦР является прямым, т. е. позволяет непосредственно выявить причину заболевания, в данном случае обнаружить патогенный микроорганизм, то биоматериал необходимо брать непосредственно в месте предполагаемой локализации инфекционного процесса. Исследование некоего “универсального материала”, как например кровь, не позволит определить наличие в организме патогена во всех случаях за исключением тех, при которых возбудитель локализован именно в крови. В первую очередь это относится к патогенам, которые могут поражать многие органы и ткани, таким как, например, Chlamydia trachomatis или Mycobactrium tuberculosis.

Chlamydia trachomatis могут поражать эпителий слизистой оболочки урогенитального тракта, эпителий конъюнктивы глаза и синовиальной полости. Следовательно, при подозрении на урогенитальный хламидиоз материалом для исследования должен служить соскоб из урогенитального тракта, при поражении глаз у новорожденного — соскоб из конъюнктивы глаза, при хламидийном артрите — пунктат синовиальной жидкости.
Mycobactrium tuberculosis могут поражать практически любой орган и ткань организма человека, т. е. материал для исследования не должен быть одним и тем же при разных формах патологического процесса.
Таким образом, если у ребенка хламидиоз глаз, а для исследования взят образец из урогенитального тракта, а при туберкулезе почек для исследования берется мокрота, отрицательный результат не будет исключать факта инфицирования пациента.

• Вторая ошибка на преаналитическом этапе, – неправильное взятие материала на исследование.

Общими требованиями к биологическому материалу являются максимальная концентрация микроорганизмов в образце, а также отсутствие нежелательных примесей, ингибирующих ПЦР.
Например, Chlamydia trachomatis – облигатные внутриклеточные паразиты, следовательно, исследуемый материал должен содержать большое количество клеток эпителия. То есть, при взятии материала для выявления этих микроорганизмов необходимо делать соскоб, а не мазок, поскольку в мазке Chlamydia trachomatis не будут обнаружены, даже если находятся в организме в значительном количестве.
При взятии материала из урогенитального тракта необходимо избегать ингибирующих примесей, таких как слизь, кровь или гной. Для этого соскобы берут не ранее, чем через два часа после мочеиспускания, у женщин учитывают дни цикла. Избыток слизи или гноя необходимо удалить стерильным ватным тампоном непосредственно перед взятием биоматериала. Забирать материал желательно специальными пластиковыми зондами, что снижает вероятность появления крови в образце, к тому же они в отличие от ватных не сорбируют транспортную среду и исследуемый материал.

Правильное взятие урогенитального соскоба – процедура болезненная для лиц мужского пола и детей, поэтому для исследования можно использовать первую порцию утренней мочи, содержащую максимальное количество эпителия. В последующем для работы необходимо получить клеточный осадок мочи. Однако осадок содержит большое количество солей и мочевины, которые, при использовании технологий флуоресцентной детекции, денатурируют зонды, что может привести к ложноположительным результатам. Поэтому клеточный осадок мочи необходимо в обязательном порядке промывать физиологическим раствором.

Следующая ошибка преаналитического этапа – неправильная обработка взятой крови. Для предотвращения свертываемости крови в процессе доставки необходимо использовать антикоагулянты. Во многих лабораториях в качестве антикоагулянта используется гепарин. Однако гепарин достаточно сильно ингибирует ПЦР, и, независимо от используемой тест-системы и способа пробоподготовки, все результаты для образца, его содержащего, окажутся недостоверными в случае наличия внутреннего контроля ПЦР или отрицательными, независимо от реального положения вещей, в случае, если внутреннего контроля нет.

Необходимо помнить о температуре хранения биологического материала, а также сроках и способах его доставки в ПЦР-лабораторию в случае, если транспортировка требует значительного времени. При нарушении сроков хранения или транспортировки биоматериала ДНК или РНК возбудителя может разрушаться, что приведет к ложноотрицательным результатам. Образцы рекомендуется хранить при температуре от 2 до 8 оС в течение нескольких часов, для более длительного хранения необходимо замораживание. Единственное исключение – кровь, поскольку цельную кровь замораживать нельзя! Необходимо получить плазму и уже ее замораживать. Заморозка должна быть однократной, в противном случае происходит разрушение нуклеиновых кислот.

Ошибки аналитического этапа, как правило, связаны с невнимательным чтением инструкции, прилагаемой к набору для провеения ПЦР-анализа.

1.  Одной из таких ошибок является неправильный выбор системы пробоподготовки. Менее опасно применение экспресс-методов для сложных биоматериалов — таких как, например, плазма крови, потому что в этом случае наиболее вероятно получение недостоверных результатов из-за оставшихся в пробе ингибиторов ПЦР, что в свою очередь, вынудит специалиста КДЛ повторить эксперимент и выяснить причину неудачи. Гораздо опаснее, если из-за неправильно выбранной тест-системы в процессе пробоподготовки теряется часть или вся ДНК или РНК возбудителя – в этом случае есть риск получения ложноотрицательного результата.
2. Вторая ошибка – неправильно приготовленные фоновые пробирки для тест- систем с флуоресцентной детекцией по конечной точке. Чаще всего это связано с тем, что сотрудник лаборатории забывает их менять при появлении новой серии реактивов или не делает этого из соображений экономии. Возможно, что одни и те же компоненты реакционной смеси едва ли будут иметь различный уровень флуоресценции, однако в разных сериях реактивов могут отличаться концентрации компонентов и высока вероятность различного уровня флуоресценции. Таким образом, ошибка, которую в некоторых случаях можно не заметить, в других может дать большое количество недостоверных результатов.
3. Еще одной ошибкой, связанной с неправильным приготовлением фоновых пробирок, является добавление в них полимеразы. Это может произойти как случайно, так и вследствие того, что лаборант не до конца понимает, почему полимеразу добавлять не нужно. Здесь могут быть два варианта развития событий:

• если в тест-систему не входит внутренний контроль или в качестве отрицательного контрольного образца используется буфер не прошедший выделения
• если в тест- систему входит внутренний контроль, который находится под парафином и/или отрицательный образец проходит стадию выделения. В первом случае добавление полимеразы может существенно не сказаться на результате, однако и в этом случае есть риск контаминации как положительным, так и внутренним. Во втором случае все отрицательные значения оказываются недостоверными. Обнаружить ошибку не представляется проблемой, поскольку нормировочные значения оказываются очень высокими, близкими к 103, а значения флуоресценции в некоторых пробирках – существенно ниже 1.

1. Проблема контаминации возникает при неправильной организации лаборатории или при неаккуратном обращении с положительными образцами. Так, при использовании гель-электрофореза в качестве метода детекции, комната для его проведения обязательно должна иметь отдельный вход и систему вентиляции. В противном случае вероятность того, что ампликоны из открывающихся пробирок будут попадать в другие помещения, очень высока. Это может привести к тому, что со временем все больше исследуемых образцов на часто встречающиеся инфекции будут оказываться положительными. При этом на первых этапах такого загрязнения отрицательный контроль может оставаться чистым, поскольку появление ложноположительных результатов носит статистический характер.
2. В случае флуоресцентной детекции пробирки не открываются и теоретически вероятность контаминации близка к нулю, однако возможность ее открытия не исключена. Поэтому лучше, если амплификация и детекция будут проводиться в отдельной комнате, тогда в случае непредвиденной ситуации контаминированна окажется одна комната.
3. Еще одна ошибка, приводящая к контаминации образцов, связана с неаккуратным обращением как с клиническими пробами, так и с положительными контрольными образцами и стандартами. Некоторые специалисты лаборатории с целью экономии при внесении в большое количество пробирок одного и того же вещества используют один наконечник. Это нормально, если пробирки пустые или их содержание одинаково (подготовка амплификационных пробирок). Однако, если в пробирке находится образец, как, например, при пробоподготовке, то при внесении даже одного и того же раствора в разные пробирки увеличивается риск переноса ДНК между пробирками – так называемая кросс-контаминация. С целью предотвращения кросс-контаминации так же рекомендуется для внесения образцов, потенциально содержащих ДНК, использовать наконечники с фильтрами.

Помимо этого, при неаккуратной работе есть риск внести в пробу ингибиторы (например, тальк с перчаток).

Говоря об ошибках при интерпретации результатов, имеет смысл рассмотреть различные способы детекции.

1. При детекции с использованием гель-электрофореза есть риск принять неспецифические фрагменты за специфичные, если они близки по длине и нет возможности четко и однозначно сравнить положительным контроем и, в идеале, с маркером длин. Также, поскольку образцы часто наносятся на гель одним наконечником, существует риск контаминации уже на этапе детекции, если наконечник плохо промывался или одна из проб оказалась с очень высокой концентрацией ДНК. Такого рода контаминация легко отслеживается в случае, если полоса наблюдается в заведомо отрицательной пробе, однако она неотличима от контаминации в лаборатории и требует повторной проверки всех образцов.
2. Одной из ошибок интерпретации, связанных с использованием метода флуоресцентной детекции по конечной точке, является невнимательное отношение к нормировочным значениям фоновых пробирок и к значениям флуоресценции в отрицательных пробах. Так, при неправильном хранении зонды в фоновых пробирках могут разрушаться, и нормировочные значения существенно увеличиваются за срок от нескольких часов о нескольких дней, при этом значения флуоресценции в образцах оказываются в большей или меньшей степени занижены. Главным критерием достоверности полученных результатов в данном случае могут служить отрицательные пробы. При отсутствии расхождений между фоновыми и амплификационными пробирками отрицательные образцы имеют значения флуоресценции близкие к единице или, в редких случаях, чуть выше. Если значения флуоресценции в одном или нескольких образцах или отрицательном контроле существенно ниже единицы, с большой долей вероятности можно утверждать, что фоновые пробирки не соответствуют данному исследованию, в этом случае необходимо их поменять.

Помимо вышеприведенного примера, может случиться так, что фоновая флуоресценция возрастает в амплификационных пробирках, в то время как в фоновых пробирках флуоресценция остается неизменной. Такая ситуация может возникнуть, когда амплификационные пробирки хранятся при комнатной температуре. В этом случае будет увеличиваться содержание положительных результатов с низкими значениями флуоресценции. Результаты при этом поучаются такие же как при контаминации в лаборатории, однако в данном случае все низкие значения флуоресценции будут примерно одинаковы, что в случае контаминации встречается достаточно редко, поскольку маловероятно, что во все отрицательные пробирки попадет равное количество постороннего материала. Подобного легко избежать, если менять фоновые пробирки раз в месяц–полтора, в этом случае, как правило, не успевает появиться достаточно большая разница между уже готовыми фоновыми и амплификационными пробирками.
3 Наиболее частая ошибка при исследовании методом ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени связана с прибором, который при больших колебаниях флуоресценции может зафиксировать ложноположительные результаты. В связи с этим необходимо проводить анализ индивидуальной кривой. Пороговая линия должна пересекать индивидуальную кривую в области начала экспоненциального роста, и это не один из множества пиков колебания флуоресценции. Также прибор может выдать ложноотрицательный результат в случае, если на первых циклах ПЦР по каким-то причинам произошло существенное уменьшение флуоресценции. Эту ошибку можно обнаружить при анализе исходных кривых флуоресценции. Если образец положительный, то на исходной кривой будет виден четкий экспоненциальный рост. Для большей достоверности можно сравнить такую сомнительную кривую с кривой заведомо положительной. Все положительные кривые имеют сходный угол наклона и уровень флуоресценции при выходе на плато заметно отличается от колебаний в отрицательных образцах.

Ошибки на завершающем, постаналитическом этапе, связаны с неверной интерпретацией врачом результатов ПЦР-анализа вследствие ошибочных представлений об инфекционном агенте или о возможностях метода.
Например, контрольное исследование на хламидиоз через 1 неделю после окончания курса антибиотиков даст положительный результат. Врач сделает вывод о неэффективности проведенной терапии. Однако окончательный вывод можно сделать не ранее чем через 4–6 недель, после того как сменится эпителиальный слой, в котором паразитирует данный микроорганизм. Более ранняя диагностика может показать неверный результат, поскольку в клетках эпителия еще сохраняются погибшие микроорганизмы.

Важно учитывать специфичность используемых тест-систем. Так, например, пациент с предполагаемым диагнозом “респираторный хламидиоз” направляется на исследование. При постановке ПЦР используется видоспецифическая тест-система для выявления ДНК С. Trachomatis – результат исследования отрицательный. Однако врач не должен снимать предполагаемый диагноз, поскольку инфекция может быть вызвана другими видами хламидий, например С. pneumonia, C. pecorum, C. psitaci, которые не диагносцируются данной тест- системой. То есть при назначении ПЦР-исследования врач должен очень четко представлять границы специфичности применяемых тест-систем.
Вместе с тем не несовпадение результатов различных методов исследования не говорит об ошибке. Зачастую ПЦР-исследование дает положительный результат, в то время, как ИФА – отрицательный, либо наоборот. Несовпадение результатов исследований может объясняться, например, периодом “серологического окна”.
В случае обратных результатов исследований возможен “иммунологический след” – остаточный уровень антител, который у некоторых людей может сохраняться многие месяцы и даже годы после выздоровления, либо при проведении ПЦР не учитывается видоспецифичность тест-систем.
Приведенные примеры показывают, что необходима обратная связь между специалистами ПЦР-лаборатории и врачами-клиницистами, для осуществления точной диагностики в сложных случаях и выработки правильной стратегии лечения пациента.

Положительный результат в ПЦР и отрицательный результат в ИФА может быть обусловлен наличием «серологического окна», что наиболее актуально для выявления вирусов гепатитов и иммунодефицита человека. В условиях постоянно повышающихся концентраций антигена в результате репродукции вируса происходит активное снижение концентрации антител за счет включения их в состав иммунных комплексов «антиген – антитело». Также происходит подавление гуморального звена иммунного ответа в результате синтеза набора цитокинов, стимулирующих клеточное звено иммунитета. Как следствие, в течение инфекционного процесса наблюдается длительное «серологическое окно» от момента заражения до сероконверсии.
Обычно заметное количество антител к ВИЧ появляется в крови через 2–10 недель после заражения, однако разброс во времени может быть весьма велик: у 90–95 % зараженных они обнаруживаются в течение трех месяцев после заражения, у 5–9 % –через шесть месяцев, а у 0,5–1 % – и в более поздние сроки.
Выявление ДНК/РНК-вируса методом ПЦР позволяет уменьшить продолжительность «серологического окна» в среднем на 11 дней и обнаружить патоген уже через 1–2 недели после заражения.
Проведение ПЦР позволяет выявить РНК-вируса гепатита С не только в сыворотке крови, но и в биоптате печени, что важно при подтверждении роли вируса гепатита С в формировании гепатоцеллюлярной карциномы. У подобных больных РНК-вируса гепатита С регистрируется в гепатоцитах и при отсутствии anti-HCV и РНК вируса гепатита С в сыворотке крови. У ряда больных с самоограничивающимся течением инфекции anti-HCV не появляются никогда.
В соответствии с Рекомендациями МЗ РК по диагностике и лечению взрослых больных гепатитом С (2014) особую диагностическую ценность для установления диагноза «острый гепатит С» (ОГС) имеет обнаружение анти-ВГС в динамике болезни (через 4–6 недель) при отрицательном результате исследования этого маркера в ранние сроки болезни, а также исключение гепатита иной природы. Наличие РНК ВГС в фазе «серологического окна» (в период отсутствия анти-ВГС) – важный критерий диагноза среди комплекса диагностических признаков ОГС. Если у пациента в сыворотке крови определяется РНК ВГС на протяжении более 6 месяцев, то можно говорить о хроническом гепатите С.

 В том случае, если у пациента зарегистрирован положительный тест на анти-ВГС, но РНК ВГС обнаружить не удается, оснований для диагноза ХГС недостаточно. Кроме того, нужно помнить о необходимости дифференциального диагноза ХГС с ОГС, который в 80 % случаев протекает в безжелтушной форме. РНК ВГС может определяться в крови уже через 2 недели от момента заражения, еще до появления анти-ВГС; последние могут не отмечаться в течение первых 8–12 недель.
Кроме того, отсутствие положительных результатов ИФА на фоне положительного результата в ПЦР может наблюдаться у иммуносупрессивных пациентов и новорожденных с перинатальной инфекцией (нетипичная картина, связанная с антителами матери). Так, при хроническом хламидиозе до 5 % больных имеют титр антихламидийных антител, не превышающий критического уровня.
Аналогичная проблема может возникнуть при диагностике сифилиса в том случае, если заболевание проходит стадию первичного серонегативного сифилиса, когда стандартные серологические реакции крови еще отрицательные (первые 3–4 недели от возникновения твердого шанкра).
При заболеваниях, передающихся половым путем, скрытый период инфекции, когда уровень иммуноглобулинов не больше нормы, составляет в среднем 14 дней.
Кроме того, важно учитывать возможность высокой генетической изменчивости микроорганизмов, которая приводит к формированию серонегативных штаммов.
При обследовании новорожденных на наличие внутриутробных инфекций может быть получен ложноотрицательный результат серологического исследования не только вследствие влияния высокой концентрации материнских антител класса IgG (маскируют наличие IgM у ребенка), но и развития иммунологической толерантности.
Иммунологическая толерантность – неспособность организма к иммунному ответу на определенный антиген. Сроки ее формирования варьируются от нескольких часов до нескольких суток, а ее длительность зависит от персистенции антигена в организме и скорости образования иммунокомпетентных клеток из их предшественников. Индукции толерантности способствует неспецифическая иммунодепрессия (в том числе под влиянием лекарственных препаратов).
Генетически обусловленная серонегативность ряда заболеваний делает их недоступными для анализа стандартными серологическими методами, а при исследовании методом ПЦР обеспечивается положительный результат, например, серонегативные спондилоартриты (ССА) – заболевания, которые характеризуются поражением крестцово-подвздошных сочленений и имеют тенденцию к семейной агрегации. В группу ССА включают 10 заболеваний: идиопатический анкилозирующий спондилоартрит, псориатический артрит, болезнь Рейтера, язвенный колит, болезнь Крона, болезнь Уиппла, ювенильный хронический артрит, реактивный артрит (иерсиниозный, шигеллезный, сальмонеллезный), острый передний увеит, синдром Бехчета, – объединенных при обследовании наличием антигена HLA-B27.
Еще один вариант несовпадения результатов ПЦР и ИФА (отрицательный результат в ПЦР и положительный результат в ИФА) может быть обусловлен выявлением «иммунологического следа» – остаточного уровня IgG после ранее перенесенной инфекции. У некоторых людей повышенный уровень антител может сохраняться многие месяцы и годы после полного выздоровления, что связано с индивидуальными особенностями иммунной системы.

Например, в случае подозрений на атипичную пневмонию выбор тест-системы, выявляющей несколько видов хламидий, в первую очередь респираторных (С. pneumonia, C. pecorum, C. psittaci), определяет получение положительного результата. При этом направление на анализ методом ПЦР с указанием только наиболее распространенного этиологического агента хламидийной пневмонии – С. Рneumonia может привести к получению отрицательного результата. Это будет связано с использованием видоспецифической тест-системы, направленной на выявление только указанного вида микроорганизма, тогда как возбудителем инфекционного процесса может быть C. psittaci.

Материал для ПЦР должен быть получен из места предполагаемой локализации инфекционного и/или неинфекционного воспалительного процесса, а для получения достоверного результата ИФА данный подход не является критичным.
Например, при хламидийном сальпингите (воспалении маточной трубы) в крови пациентов будет определяться устойчивый уровень специфических антител, тогда как при анализе соскобного материала из влагалища или шейки матки методом ПЦР хламидии обнаружены не будут. Учитывая тот факт, что в 50 % случаев заболевание протекает атипично, интерпретация результата ПЦР как отрицательного может привести к тяжелым последствиям, поэтому для подтверждения положительного результата ИФА и постановки диагноза показана лапароскопия (гидросальпинкс).
Тем не менее, сравнивая возможности ИФА и ПЦР в диагностике заболеваний, следует отметить, что метод ПЦР не позволяет установить стадию инфекционного процесса. В связи с этим роль ИФА в интерпретации результатов исследования может быть весьма существенной, поскольку данный метод позволяет определить авидность антител.
Авидность – это прочность связи между антителом и антигеном, которая отражает сроки заражения и длительность инфекционного процесса. Определение индекса авидности (ИА) ниже 30–35 % указывает на свежую первичную инфекцию, показатель авидности, равный или превышающий 40 %, указывает на то, что в сыворотке содержатся анамнестические высокоавидные антитела, свидетельствующие об инфекции в прошлом. ИА в интервале 31–39 % может свидетельствовать о поздней стадии первичной инфекции или недавно перенесенной инфекции только при условии выявления антител в высокой концентрации.

Положительный контрольный образец (ПКО) представляет собой искусственно синтезированную олигонкулеотидную последовательность, строго соответствующую искомой. Соответственно, праймеры для ПКО и искомой мишени одинаковые, что позволяет удостовериться в работоспособности и сохранности компонентов РС, необходимых для нормального прохождения ПЦР.
ПКО является одним из специфических компонентов наборов реагентов. Оптимальным вариантом внешнего ПКО является использование в качестве последнего сертифицированной культуры выявляемого возбудителя. Вместе с тем в наборах, предназначенных, например, для выявления и идентификации возбудителей опасных и особо опасных инфекционных заболеваний, такой вариант ПКО значительно уменьшает возможность использования указанных наборов реагентов вне специализированных лабораторий, имеющих соответствующий уровень безопасности. В связи с этим в общем случае использование в качестве ПКО нативных возбудителей нецелесообразно.
ПКО позволяет удостовериться, что все компоненты, входящие в состав реакционной смеси, обеспечивают нормальное прохождение реакции.

Отрицательный контрольный образец (ОКО) включает в себя все компоненты реакции, но вместо клинического материала или препарата НК вносится соответствующее количество деионизованной воды или экстракта, не содержащего исследуемую ДНК. Отрицательный контроль необходим для проверки компонентов реакции на отсутствие в них ДНК или клеток возбудителя вследствие контаминации и исключения учета ложноположительных результатов.

Препарат НК может содержать примеси ингибиторов, которые заметно снижают эффективность ПЦР, а в некоторых случаях могут приводить к полному отсутствию результатов исследования. Кроме того, возможны ошибки на этапе составления РС (например, не добавили какой-либо компонент или саму НК), несоблюдение температурного режима хранения наборов реагентов или отдельных их частей (например, размораживание и потеря активности ферментов) и ряд других технических моментов, которые напрямую влияют на результаты ПЦР. Поэтому становится необходимым контролировать ход амплификации в каждой пробирке с реакционной смесью. Для этого в состав РС вводят дополнительный внутренний контроль (ВК).
ВК – это искусственно сконструированный препарат ДНК или РНК, который имеет принципиально отличную от искомой олигонуклеотидную последовательность. Для ВК в состав РС вводят собственные, строго комплементарные праймеры. Концентрация ВК в РС должна быть такой, чтобы не составлять конкуренции для амплификации даже единичных искомых молекул НК.
Наличие ампликонов ВК является свидетельством нормального прохождения реакции амплификации. Если ампликоны искомой НК отсутствуют, но не образовались также и ампликоны ВК, можно сделать вывод о технологических нарушениях либо о наличии в анализируемом образце нежелательных примесей. В любом случае результат реакции следует признать недостоверным.
Добавление внутреннего контрольного образца на стадии выделения ДНК позволяет определить, насколько эффективно произошло выделение ДНК в каждой конкретной пробирке. Использование внутреннего контрольного образца именно на стадии выделения ДНК позволяет получить максимально полную информацию о возможной ошибке в работе. Так, при использовании его только на этапе амплификации можно судить лишь о присутствии или о наличии ингибиторов ПЦР в реакционной смеси, тогда как неэффективное выделение ДНК не будет обнаружено.
Если внутренний контрольный образец внести в реакционную смесь, то он станет такой же мишенью для отжига праймеров, как и ДНК искомого возбудителя инфекции. Размер продукта амплификации внутреннего контрольного образца подбирают таким образом, чтобы он был в 2 раза и более больше, чем ампликоны, образуемые от амплификации искомой ДНК микроорганизма. В результате при внесении ДНК внутреннего контрольного образца реакционную смесь вместе с испытуемым образцом независимо от наличия микроорганизма в биологическом образце внутренний контрольный образец станет причиной образования специфических ампликонов, но значительно более длинных (тяжелых), чем ампликон микроорганизма. Наличие тяжелых ампликонов в реакционной смеси будет свидетельством нормального прохождения реакции амплификации и отсутствия ингибиторов. Если ампликоны нужного размера не образовались, но не образовались также и ампликоны внутреннего контрольного образца, можно сделать вывод о наличии в анализируемом образце нежелательных примесей, от которых следует избавиться, но не об отсутствии искомой ДНК.
К сожалению, несмотря на всю привлекательность такого подхода, у него есть существенный недостаток. Если в реакционной смеси находится нужная ДНК, то эффективность ее амплификации резко снижается из-за конкуренции с внутренним контрольным образцом за праймеры. Это принципиально важно при низких концентрациях ДНК в испытуемом образце, что может приводить к ложноотрицательным результатам.
Препараты геномной РНК не могут быть эффективно использованы в указанном качестве в силу их низкой стабильности [10]. Поэтому в качестве внутреннего контрольного образца при выявлении и идентификации РНК-содержащих вирусов с помощью ПЦР в последнее время широко используют так называемую армированную РНК [11, 14, 15, 17, 18]. В работе X.-F. Yu и соавт. [18] описано приготовление «армированной» РНК, используемой в качестве внутреннего ПКО в мультиплексной тест-системе для выявления вирусов гриппа и вируса тяжелого острого респираторного синдрома с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени. Методика приготовления «армированной» РНК включает следующие этапы:
• получение выбранного кДНК-фрагмента геномной РНК возбудителя;
• получение ДНК-фрагмента, содержащего информацию о синтезе белка оболочки фага MS2;
• амплификацию указанных фрагментов и встраивание их в плазмиду pMS27;
• трансформацию рекомбинантной плазмиды клеток Е. coli, штамм BL21 (DE3);
• индукцию экспрессии белка оболочки фага MS2 изопропил-β-D-тиогалактопиранозидом;
• осаждение клеток Е. coli;
• инкубацию супернатанта с избытком ДНКаз и/или РНКаз;
• проверку полученного продукта с помощью электрофореза;
• очистку полученного комплекса РНК–белок с помощью электроэлюции в агарозном геле;
• проверку конечного продукта в ОТ-ПЦР в реальном времени.
Конечный продукт представляет собой фрагменты специфических РНК, упакованные в белок оболочки фага MS-2 («армированную» РНК).
Универсальный внутренний контрольный образец добавляют в количестве 10 мкл препарата в 300 мкл лизирующего раствора непосредственно перед добавлением пробы. Дальнейшее выделение ДНК происходит по обычной методике. После регистрации продуктов амплификации полоса, соответствующая внутреннему контрольному образцу, должна проявиться во всех пробах, в которые был добавлен препарат. Отсутствие этой полосы может свидетельствовать об ошибках на стадии выделения ДНК либо на стадии амплификации ДНК. В таких случаях необходимо поставить ПЦР с ДНК, выделенной из той же пробы еще раз, при повторном отсутствии полосы внутреннего контрольного образца необходимо провести повторное выделение пробы
ВК может быть использован не только непосредственно в составе РС для амплификации, но и для контроля качества выделения НК. Для этого его вводят в каждую пробирку с исходным или предварительно обработанным образцом, проводят через этап выделения и только потом добавляют в РС. Введение ВК с известной концентрацией на этапе выделения особенно важно для контроля количественного ПЦР-анализа.

Использование специальных контролей при постановке ПЦР позволяет решить ряд задач, в первую очередь касающихся оценки эффективности процесса амплификации и контроля специфичности полученных результатов, а также дает возможность реализовать подход к количественному анализу ДНК. Принципиальным моментом является постановка специальных контролей при исследовании сложных многокомпонентных систем, таких как биоценозы, поскольку появляется возможность качественного и количественного анализа взаимодействия компонентов системы и характеристики их отношения к биотопу.

К специальным контролям можно отнести следующие:

•  маркеры длин фрагментов ДНК
• контроль фона
• стандарты и калибраторы
• контроль взятия материала (КВМ).

Маркеры длин фрагментов ДНК используются при детекции результатов ПЦР методом гель-электрофореза. Стандарты (маркеры) представляют собой фрагменты двухцепочечной ДНК строго определенной длины, позволяющие идентифицировать и охарактеризовать полосы, полученные в геле, и оценить результаты анализа с точки зрения их специфичности.
Контроль фона используется для ПЦР с флуоресцентными методами детекции результатов, причем данный тип контроля наиболее актуален для ПЦР с детекцией результатов по конечной точке (см. ниже). Анализ уровней флуоресценции искомой мишени и фоновой флуоресценции позволяет установить некоторое пороговое значение и определить критерии достоверности положительного и отрицательного результатов ПЦР с детекцией результатов по конечной точке. Важно, что на величину фоновой флуоресценции могут повлиять: свойства меченых зондов; изменения концентрации отдельных компонентов реакционной смеси в зависимости от серии, режима и продолжительности хранения; свойства используемого пластика; особенности регистрирующей аппаратуры. Поэтому фоновые пробирки должны готовиться в соответствии с инструкцией к применяемому набору реагентов, рекомендациями производителя и к каждой новой серии наборов реагентов.
NB !!! Фоновые пробирки в рамках одной серии могут быть использованы многократно, поэтому чрезвычайно важно соблюдать режим хранения, соответствующий режиму, определенному для всего набора реагентов.
Стандарты и калибраторы наиболее часто используются при осуществлении количественного анализа методом ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени. Стандарт – произвольный фрагмент ДНК или РНК, ограниченный теми же праймерами, что и для искомой мишени. Известные концентрации стандарта соответствуют определенным значениям порогового цикла Ct (номер первого цикла, в котором происходит увеличение флуоресцентного сигнала репортерной группы по сравнению с уровнем фонового сигнала; его величина зависит от исходного количества копий матрицы и от эффективности амплификации ДНК). Введение этого типа контролей предполагает построение калибровочного графика, из которого находят концентрацию искомой НК в исследуемом образце. Точность метода зависит от того, насколько условия ПЦР серии стандартов (прежде всего эффективность амплификации) близки к условиям ПЦР экспериментальных образцов.
Для определения количества матрицы в ПЦР-РВ существуют следующие варианты стандартов:

• очищенный продукт ПЦР-РВ
• рекомбинантная ДНК
• рекомбинантная РНК с последующей обратной транскрипцией;
• синтетический олигонуклеотид, содержащий амплифицируемую последовательность.

Использование стандартов и калибраторов позволяет определить концентрацию ДНК в двух вариантах (например, при анализе на наличие патогенных микроорганизмов в пробе):

•  количество геномных эквивалентов клеток микроорганизмов в единице объема клинического образца (ГЭ/мл), что отражает абсолютную концентрацию данных микроорганизмов в клиническом материале
• расчет соотношения количества геномов на количество геномов клеток человека.

Для этой цели в ПЦР-смеси наряду с калибраторами ДНК микроорганизма присутствуют калибраторы человеческой ДНК. Полученные таким образом относительные значения концентрации ДНК микроорганизма к ДНК человека
могут отражать плотность обсемененности искомыми микроорганизмами.
Контроль взятия материала – ключевой момент в определении качества взятой для исследования пробы. Данный подход позволяет исключить ошибки преаналитического этапа при исследовании биологического материала, содержащего клетки человека, и избежать получения недостоверных, ложноположительных или ложноотрицательных результатов ПЦР. Кроме того, он может быть использован для оценки количества геномной ДНК человека.
Таким образом, существует спектр подходов, обеспечивающий получение достоверных результатов, которые позволяют контролировать качество и эффективность прохождения ПЦР и оптимизировать работу лаборатории.