Галымжан сейтгалиев
Лекция №2
ПЦР — альтернатива клонированию для получения, в сущности, неограниченных количеств интересующей ДНК-последовательности. ПЦР за несколько часов может избирательно увеличить в количестве единственную молекулу ДНК до нескольких миллионов копий,
ПЦР — ферментативное «умножение» или амплификация фрагмента ДНК, расположенного между двумя олигонуклеотидами, так называемыми праймерами. Праймеры разрабатывают таким образом, что первый комплементарен одной нити молекулы ДНК с одной стороны целевой последовательности, а второй — другой нити противоположной стороны этой же последовательности.
Регулярные циклы тепловой денатурации, гибридизации праймеров и ферментативного синтеза ДНК приводят к экспоненциальному росту (2, 4, 8,16, 32,...) числа копий целевой последовательности ДНК. В результате количество копий участка ДНК между праймерами будет увеличиваться до тех пор, пока не израсходуются субстраты реакции (праймеры и нуклеотиды). При использовании специально разработанных приборов для ПЦР цикл амплификации занимает всего несколько минут. Таким образом, в течение нескольких часов могут быть получены миллиарды копий стартовой молекулы ДНК.
ПЦР — ферментативное «умножение» или амплификация фрагмента ДНК, расположенного между двумя олигонуклеотидами, так называемыми праймерами. Праймеры разрабатывают таким образом, что первый комплементарен одной нити молекулы ДНК с одной стороны целевой последовательности, а второй — другой нити противоположной стороны этой же последовательности.
Регулярные циклы тепловой денатурации, гибридизации праймеров и ферментативного синтеза ДНК приводят к экспоненциальному росту (2, 4, 8,16, 32,...) числа копий целевой последовательности ДНК. В результате количество копий участка ДНК между праймерами будет увеличиваться до тех пор, пока не израсходуются субстраты реакции (праймеры и нуклеотиды). При использовании специально разработанных приборов для ПЦР цикл амплификации занимает всего несколько минут. Таким образом, в течение нескольких часов могут быть получены миллиарды копий стартовой молекулы ДНК.
Механизм полимеразной цепной реакции
Метод основан на многократном избирательном копировании определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. В о тличие от амплификации ДНК в живых организмах, (репликации), с помощью ПЦР амплифицируются относительно короткие участки ДНК. В обычном ПЦР-процессе длина копируемых ДНК-участков составляет не более 3000 пар оснований (3 kbp). С помощью смеси различных полимераз, с использованием добавок и при определённых условиях длина ПЦР-фрагмента может достигать 20-40 тысяч пар нуклеотидов. Это всё равно значительно меньше длины хромосомной ДНК эукариотической клетки. Например, геном человека состоит примерно из 3 млрд пар оснований.
Компоненты реакционной смеси
ДНК-матрица
Матрица для синтеза дочерних цепей - образец ДНК с целевой последовательностью. Он может быть от любой клетки, содержащей ДНК.
Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ)
дезоксиаденозинтрифосфа-та (дАТФ), дезоксигуанозинтрифосфата (дГТФ), дезоксицитозинтрифосфата (дЦТФ) и дезокситимидинтрифосфата (дТТФ) - "строительный материал", используемый Taq-полимеразой для синтеза второй цепи ДНК. Концентрация dNTPs в реакционной смеси равна обычно 0,2 мM. Увеличение концентрации dNTP’s выше 0,2 мM приводит к снижению специфичности и точности ПЦР. Снижение концентрации dNTP’s снижает частоту ошибок фермента, однако приводит к снижению выхода ПЦР-продукта
Taq-полимераза
термостабильный фермент, обеспечивающий достраивание 3'-конца второй цепи ДНК согласно принципу комплементарности . Устойчивость Taq-полимеразы к температуре определяется временем, приводящим к потере 50% ферментативной активности. При 92,5 0 С это время составляет 130 мин., при 950С – 40 мин. и при 970С - 5 мин. После 50 циклов ПЦР с параметрами денатурации 950С в течение 20 сек активность фермента падает примерно на 65%
Ионы Mg2+
необходимые для работы полимеразы. Концентрацию ионов магния ранее оптимизировали для каждого конкретного эксперимента. Ионы магния образуют комплексы с dNTPs, праймерами и матрицей ДНК и поэтому концентрация Mg2+ влияет на отжиг праймеров, температуру диссоциации матричной и амплифицированной ДНК, специфичность продукта, активность и точность ДНК-полимеразы. Для нормальной работы ДНК-полимеразы необходимо наличие свободных ионов магния, а не только тех, которые связаны с ДНК матрицей, праймерами и dNTPs. Универсальная концентрация Mg2+ составляет 1,5 мМ при 0,2 – 0,25 мМ dNTP’s
Буферный раствор
обеспечивающий необходимые условия реакции — рН, ионную силу раствора. смесь катионов и анионов в определенной концентрации, обеспечивающих оптимальные условия для реакции, а также стабильное значение рН. Анализируемый образец - подготовленный к внесению в реакционную смесь препарат, который может содержать искомую ДНК, например, ДНК микроорганизмов, служащую мишенью для последующего многократного копирования. При отсутствии ДНК-мишени специфический продукт амплификации не образуется.
Праймеры
искусственно синтезированные олигонуклеотиды, имеющие, как правило, размер от 15 до 30 п.н., идентичные соответствующим участкам ДНК-мишени. Они играют ключевую роль в образовании продуктов реакции амплификации. Правильно подобранные праймеры обеспечивают специфичность и чувствительность тест-системы. Каждый из праймеров комплементарен одной из цепей двуцепочечной матрицы, обрамляя нач ало и конец амплифицируемого участка. После гибридизации матрицы с праймером (отжиг), последний служит затравкой для ДНК-полимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы. Концентрация праймеров обычно варьирует в пределах 0,1 – 1 μМ. Более высокая концентрация праймеров может приводить к образованию неспецифических продуктов
Праймеры следует подбирать с учетом следующих требований:
- содержание оснований Г и Ц в праймере должно находиться в пределах 40-60%;
- основания Г и Ц должны быть равномерно распределены по всей длине праймера; желательно чтобы на 3'-конце праймера находилось основание Г или Ц, так как это увеличивает эффективность ПЦР
- следует избегать наличия 3 и более оснований Г или Ц на 3’-конце праймера, поскольку это может приводить к ошибочному спариванию праймера с ГЦ-богатыми участками ДНК;
- праймеры не должны формировать стабильных дуплексов сами на себя или друг с другом; - участки отжига должны быть уникальными, т.е. праймеры не должны иметь длинных комплементарных участков вне специфических мест отжига. Наличие конкурентных участков отжига в особенности в 3'-концевой области праймера может привести к синтезу неспецифического продукта
- температура плавления (Tm) данной пары праймеров должна быть сходной и находиться в пределах 55-65оС.
Роль компонентов реакционной смеси ПЦР
1
ДНК-матрица
Матрица для синтеза дочерних цепей - образец ДНК с целевой последовательностью. Он может быть от любой клетки, содержащей ДНК.
2
Taq-полимераза
Термостабильный фермент, обеспечивающий достраивание 3'-конца второй цепи ДНК согласно принципу комплементарности . Устойчивость Taq-полимеразы к температуре определяется временем, приводящим к потере 50% ферментативной активности. При 92,5 0 С это время составляет 130 мин., при 950С – 40 мин. и при 970С - 5 мин. После 50 циклов ПЦР с параметрами денатурации 950С в течение 20 сек активность фермента падает примерно на 65%Это фермент, который на самом деле синтезирует новые нити ДНК. Обычно используются термостабильные ДНК-полимеразы, такие как Taq, потому, что их активность не нарушается при высоких температурах, а это означает, что вам не нужно добавлять больше полимеразы после высокотемпературных этапов термоцикла.
3
Дезоксинуклеозиды трифосфаты (dNTPs)
Нуклеотиды со свободным основанием, которые будут использоваться для создания новых нитей ДНК
4
Два праймера – прямой и обратный
Служат затравкой для ДНК-полимеразы. Праймеры - это короткие одиночные цепи ДНК, которые связываются по обе стороны от последовательности-мишени, чтобы обеспечить амплификацию области, которую они охватывают (взгляните на диаграмму). Они обычно около 18-30 нуклеотидов в длину.
Праймеры сконструированы таким образом, что они комплементарны областям, которые фланкируют целевой ген, поэтому они будут связываться с этими последовательностями (и только с этими последовательностями). Они также предназначены для включения определенного количества С и G нуклеотидов для изменения температуры, при которой они будут прикрепляться (отжигать) к ДНК.
5
Ионы магния (Мg2+)
Являются кофакторами для ДНК-полимеразы. Ионы Mg2+ обеспечивает раствор MgCl2. Mg2+ образует комплексы с dNTPs (именно эти комплексы являются субстратом для Taq-полимеразы), праймерами и матрицей ДНК и поэтому концентрация Mg2+ влияет на отжиг праймеров, температуру диссоциации матричной и амплифицированной ДНК
6
ПЦР-буфер
Позволяет поддерживать оптимальное значение рН раствора для проведения реакции ПЦР. Служит химической средой для поддержания активности и стабильности ДНК полимеразы.
7
Вода
Среда для протекания реакции, доведение объема реакционной смеси до необходимого
Амплификатор
ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1 °C. Современные амплификаторы позволяют задавать сложные программы, в том числе с возможностью «горячего старта», Touchdown ПЦР (см. ниже) и последующего хранения амплифицированных молекул при 4 °C. Для ПЦР в реальном времени выпускают приборы, оборудованные флуоресцентным детектором
Ход реакции: если в анализируемом образце присутствует искомая ДНК, то в процессе реакции амплификации с ней происходит ряд событий, обеспечиваемых определенными температурными циклами.
Ход реакции: если в анализируемом образце присутствует искомая ДНК, то в процессе реакции амплификации с ней происходит ряд событий, обеспечиваемых определенными температурными циклами.
При проведении ПЦР выполняется 20—35 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий
- денатурация
- отжиг
- элонгация(синтез)
Денатурация
На первом этапе необходимо расплести двойную цепь ДНК, находящуюся в образце. Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94—96°C (или до 98 °C, если используется особенно т ермостабильная полимераза) на 0,5—2 мин., чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется денатурацией, так как разрушаются водородные связи между двумя цепями ДНК. Иногда перед первым циклом (до добавления полимеразы) проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2—5 мин. для полной денатурации матрицы и праймеров. Такой приём называется горячим стартом, он позволяет снизить количество неспецифичных продуктов реакции.
Отжиг
На втором этапе праймеры присоединяются к одноцепочечной ДНК-мишени. Этот процесс носит название "отжиг" (от англ. "annealing"). Праймеры подбирают так, что они ограничивают (фланкируют) искомый фрагмент и комплементарны противоположным цепям ДНК. Отжиг происходит в соответствии с правилом комплементарности Чаргаффа, означающим, что в двухцепочечной молекуле ДНК напротив аденина всегда находится тимин, а напротив гуанина - цитозин. Если это условие не соблюдено, то отжига праймеров не происходит. Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно выбирается на 4—5°С ниже их температуры плавления. Время стадии — 0,5—2 мин. Неправильный выбор температуры отжига приводит либо к плохому связыванию праймеров с ма трицей (при завышенной температуре), либо к связыванию в неве рном месте и появлению неспецифических продуктов (при заниженной температуре). После отжига праймеров Taq-полимераза начинает достраивание второй цепи ДНК с 3 '-конца праймера.
Элонгация
На третьем этапе температуру в реакционной смеси доводят до оптимума работы Taq-полимеразы, и синтез второй цепи продолжается с максимальной эффективностью. ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Полимераза начинает синтез второй цепи от 3'-конца праймера, который связался с матрицей, и движется вдоль матрицы. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимер азы Taq и Pfu наиболее активны при 72 °C. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную ст адию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 7-10 мин. Иногда, в случае близкого значения температуры отжига праймеров и температуры оптимума работы фермента, становится возможным использовать двухэтапный ПЦР, совместив отжиг и элонгацию. Температурный цикл амплификации многократно повторяется (30 и более раз). На каждом цикле количество синтезированных копий фрагмента ДНК удваивается.
Полная денатурация матрицы ДНК на первом этапе ПЦР является критически важной
Неполная денатурация ДНК приводит к неэффективному использованию ДНК-матрицы в первых циклах и снижает выход продукта. Обычно первоначальную денатурацию ДНК проводят при 95оС в течение 1-2 мин если содержание ГЦ-оснований равно или менее 50%. При более высоком содержании ГЦоснований время денатурации можно увеличить до 5 мин. В последнем случае ДНК-полимеразу рекомендуется вносить в реакционную смесь после первоначального этапа денатурации, поскольку при температурах выше 95оС активность ДНК-полимеразы быстро снижается. Денатурацию ДНК в последующих циклах обычно проводят при 95оС в течение 0,5-1 мин. Если амплифицируемая ДНК имеет высокий ГЦ-состав, можно увеличить время денатурации до 2-4 мин без увеличения температуры. Температура отжига праймеров в значительной мере определяет специфичность реакции. Как правило, температура отжига должна быть примерно на 5о С ниже температуры плавления дублекса праймер-матричная ДНК. Установление этой температуры выше оптимального значения приводит к отсутствию продукта амплификации, а при более низких температурах происходит синтез неспецифических продуктов. В большинстве случаев отжиг праймеров проводят в течение 1-2 мин. Достройку праймеров (синтез ДНК) обычно проводят при температуре 70-75оС. В этих условиях термостабильные ДНК-полимеразы, используемые в ПЦР, проявляют максимальную активность. На практике общепринятым стандартом для большинства термофильных ДНК-полимераз является 72оС. Время достройки праймеров зависит от длины амплифицируемого фрагмента. Для амплификации фрагмента ДНК длиною менее 2 т.п.н. достаточно 1 мин инкубации. В случае более длинных фрагментов ДНК, время инкубации увеличивают примерно на 1 мин на каждую 1000 оснований.
При комнатной температуре в реакционной смеси для ПЦР происходит связывание праймеров с неспецифическими участками ДНК-матрицы и в присутствии ДНК-полимеразы инициируется синтез неспецифических продуктов. Эти нежелательные процессы в конечном итоге могут существенно снизить специфичность и чувствительность реакции. Поэтому ДНКполимеразу необходимо вносить в реакционную смесь в последнюю очередь непосредственно перед запуском реакции.Более эффективно использование так называемого "горячего старта" ПЦР (hot start PCR).
При комнатной температуре в реакционной смеси для ПЦР происходит связывание праймеров с неспецифическими участками ДНК-матрицы и в присутствии ДНК-полимеразы инициируется синтез неспецифических продуктов. Эти нежелательные процессы в конечном итоге могут существенно снизить специфичность и чувствительность реакции. Поэтому ДНКполимеразу необходимо вносить в реакционную смесь в последнюю очередь непосредственно перед запуском реакции.Более эффективно использование так называемого "горячего старта" ПЦР (hot start PCR).
- Шаг 1: 90-95oC - Это активирует энзим полимеразу
- Шаг 2: 90-95oC - Стадия денатурации: высокая температура разделяет две нити ДНК, что позволяет другим агентам в коктейле ПЦР получать доступ к генетической информации;
- Шаг 3: 55-65oC - Этап отжига: при этой более низкой температуре праймеры могут связываться с областями рядом с целевым геном, который мы хотим амплифицировать. Это связывание имеет решающее значение, так как праймеры выступают в качестве отправной точки для синтеза новых цепей, которые станут копиями целевой области;
- Шаг 4: около 72oC - Стадия синтеза: это оптимальная температура для работы фермента, позволяющая эффективно включать dNTPs полимеразой, чтобы распространить праймеры в полноразмерные копии целевой области;
- Повторение шагов 2, 3 и 4 - Повторение этапов разделения, отжига праймера и синтеза позволяет делать больше копий. Количество копий целевой области увеличивается экспоненциально, так как с каждым циклом общее количество копий удваивается, как показано на диаграмме ниже;
- Шаг 5: около 72°С - следует за повторением шагов 2-4 и гарантирует, что синтез цепей был завершен до того, как реакция остановилась;
- Шаг 6: 4°С - охлаждает реакцию до температуры, при которой она останавливается.
Таким образом, специфические фрагменты, ограниченные на концах праймерами, впервые появляются в конце второго цикла, накапливаются в геометрической прогрессии и очень скоро начинают доминировать среди продуктов амплификации. Рост требуемого продукта в геометрической прогрессии ограничен количеством реагентов, присутствием ингибиторов, образованием побочных продуктов. На последних циклах реакции рост замедл яется, это называют «эффектом плато».
"Термин "эффект плато" используют для описания процесса накопления продуктов ПЦР на последних циклах амплификации, когда количество ампликонов достигает 0,3-1 пмолей.
В зависимости от условий и количества циклов реакции амплификации, на момент достижения "эффекта плато" влияют:
"Термин "эффект плато" используют для описания процесса накопления продуктов ПЦР на последних циклах амплификации, когда количество ампликонов достигает 0,3-1 пмолей.
В зависимости от условий и количества циклов реакции амплификации, на момент достижения "эффекта плато" влияют:
- утилизация субстратов (дНТФ и праймеров);
- стабильность реагентов (дНТФ и фермента);
- количество ингибиторов, включая пирофосфаты и ДНК-дуплексы;
- неспецифические продукты или праймер-димеры, конкурирующие за праймеры, дНТФ и полимеразу;
- концентрация специфического продукта и неполная денатурация при высокой концентрации продуктов амплификации.
Матрицей для ПЦР может служить как ДНК так и РНК.
В случае однонитевой РНК в первом цикле ПЦР синтезируется комплементарная РНК цепь ДНК (кДНК) с помощью обратной транскриптазы или рекомбинантной Tthполимеразы, которая в присутствии ионов Mn2+ вместо ионов Mg2+ проявляет активность обратной транскриптазы. Это свойство Tth-полимеразы используется для амплификации однонитевых РНК-матриц со сложной вторичной структурой и ГЦ-богатым нуклеотидным составом. Полученная в первом цикле ПЦР кДНК, служит матрицей в последующих циклах.
Количество ДНК-матрицы в реакционной среде может меняться в широком интервале: от 0,001 до 1 мкг на 50/100 мкл реакционной смеси. В определенных условиях можно получить амплификацию с единичной копии матрицы. При повышении концентрации ДНК более 1 мкг/100 мкл может происходить уменьшение выхода специфического продукта ПЦР из-за образования неспецифических продуктов
В случае однонитевой РНК в первом цикле ПЦР синтезируется комплементарная РНК цепь ДНК (кДНК) с помощью обратной транскриптазы или рекомбинантной Tthполимеразы, которая в присутствии ионов Mn2+ вместо ионов Mg2+ проявляет активность обратной транскриптазы. Это свойство Tth-полимеразы используется для амплификации однонитевых РНК-матриц со сложной вторичной структурой и ГЦ-богатым нуклеотидным составом. Полученная в первом цикле ПЦР кДНК, служит матрицей в последующих циклах.
Количество ДНК-матрицы в реакционной среде может меняться в широком интервале: от 0,001 до 1 мкг на 50/100 мкл реакционной смеси. В определенных условиях можно получить амплификацию с единичной копии матрицы. При повышении концентрации ДНК более 1 мкг/100 мкл может происходить уменьшение выхода специфического продукта ПЦР из-за образования неспецифических продуктов
Количественная полимеразная цепная реакция (ПЦР)
ПЦР также можно выполнять как количественный анализ для измерения объема конкретной последовательности ДНК в образце. В начале ПЦР количество молекул амплифицируемой области ДНК с каждым циклом денатурации, гибридизации праймеров и синтеза ДНК увеличивается вдвое. Если построить график увеличения вещества, синтезированного в начале ПЦР, мы получим на полулогарифмическом графике прямую линию, показывающую, что объем продукта удваивается с каждым циклом. Количество циклов, требуемых для достижения некоего произвольного порога, зависит от того, сколько шаблона первоначально присутствовало в начале ПЦР: чем меньше циклов необходимо для достижения данного порога, тем больше шаблона, по-видимому, присутствовало вначале. Эту технику, известную как ПЦР в реальном времени, наиболее часто используют для измерения небольших количеств одной конкретной ДНК или РНК в одном образце (образец А) относительно контрольного количества РНК или ДНК в другом образце (образец Б). Важно, чтобы эффективность амплификации образца А и образца Б были сравнимыми, т.е. два прямых сегмента на графике должны быть параллельными.
Поскольку число копий в ходе ПЦР растет экспоненциально, так же растет и флуоресценция. Однако это продолжается недолго, поскольку в какой-то момент эффективность реакции начинает падать из-за постепенной инактивации полимеразы, нехватки каких-то компонентов и т.п. (рис. 31).
Анализируя графики роста флуоресценции, можно много понять о протекании ПЦР, но, самое важное, можно узнать, сколько ДНК-матриц было изначально: это так называемая количественная ПЦР (quantitative PCR, qPCR). Количественная ПЦР (греч. polymeres — состоящий из многих частей, многообразный; лат. re- — приставка, обозначающая повторность действия, и actio — действие) - вариант ПЦР, при котором непрерывно регистрируется кинетика реакции, что позволяет количественно оценивать содержание определенных нуклеотидных последовательностей ДНК в сложной смеси молекул
Анализируя графики роста флуоресценции, можно много понять о протекании ПЦР, но, самое важное, можно узнать, сколько ДНК-матриц было изначально: это так называемая количественная ПЦР (quantitative PCR, qPCR). Количественная ПЦР (греч. polymeres — состоящий из многих частей, многообразный; лат. re- — приставка, обозначающая повторность действия, и actio — действие) - вариант ПЦР, при котором непрерывно регистрируется кинетика реакции, что позволяет количественно оценивать содержание определенных нуклеотидных последовательностей ДНК в сложной смеси молекул
