Практическое занятие 3
Галымжан Сейтгалиев
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — это распространенный лабораторный метод, используемый для создания множества копий (миллионов или миллиардов!) определенного участка ДНК. Копировать можно любой интересующий нас фрагмент. Например, это может быть ген, функцию которого нужно узнать учёному, или генетический маркер, какого-либо вируса или бактерии, вызвавшее инфекционное заболевание.
ПЦР диагностика проводится в специальном аппарате – амплифакторе. Это прибор, в который устанавливаются пробирки с биологическими пробами. В зависимости от исследования амплифактор настраивается на нужное количество циклов и начинает попеременно нагревать и охлаждать пробирки, в которых в это время идут реакции. При этом создаётся однородность температуры по всей внутренней камере, необходимая температура задается буквально в один миг и регулируется с точностью до 0,1 градуса. Такая точность при нагреве и охлаждении необходима для того, что бы ни превысить пороговые значения и не испортить биоматериал
Амплификаторы роторного типа Rotor Gene 6000 (слева) и планшетного типа BioRad CFX96 (справа) – наиболее распространённые в клинико-диагностических лабораториях
Что необходимо для проведения ПЦР
- Буферный раствор
- ДНК-матрица с содержанием искомого участка генов для амплификации (содержится в экстракте из исследуемом биоматериала)
- Термоустойчивая ДНК-полимераза
- Ионы Mg2+
- Два коротких фрагмента нуклеиновой кислоты для запуска синтеза комплементарной цепи с помощью ДНК-полимеразы - праймеры
Праймеры – искусственно синтезированные олигонуклеотиды, имеющие, как правило, размер от 15 до 30 нуклеотидов, идентичные соответствующим участкам ДНК-мишени. Они играют ключевую роль в образовании продуктов реакции амплификации. Правильно подобранные праймеры обеспечивают специфичность и чувствительность тест-системы
Требования к праймерам
Быть специфичными. Особое внимание уделяют 3'-концам праймеров, так как именно с них Taq-полимераза начинает достраивать комплементарную цепь ДНК. Если их специфичность недостаточна, то высока вероятность, что в пробирке с реакционной смесью будут происходить процессы неспецифического связывания, и синтеза фрагментов различной длинны, отличных от искомых. Часть праймеров и дНТФ расходуется на синтез неспецифической ДНК, что приводит к значительной потере чувствительности.
Не должны образовывать димеры и петли, то есть не должно образовываться устойчивых двойных цепей в результате отжига (комплементарного присоединения) праймеров самих на себя или друг с другом
Область отжига праймеров должна находиться вне зон мутаций, делеций или инсерций в пределах видовой или иной специфичности, взятой в качестве критерия при выборе праймеров. При попадании на такую зону, отжиг праймеров не происходит, и, как следствие, возникает ложноотрицательный результат
Оба праймера после прикрепления направлены «внутрь» области, которую нужно копировать, то есть в направлении от 5 ’к 3’. Как и другие ДНК-полимеразы, Taq-полимераза может синтезировать ДНК только в направлении от 5’ к 3’. После удлинения праймеров область, которая находится между ними, будет скопирована.
Taq-Полимераза
Как и для репликации ДНК в организме, для ПЦР требуется фермент ДНК-полимераза, который создает новые цепи ДНК, используя существующие цепи в качестве матриц. ДНК-полимераза, обычно используемая в ПЦР, называется Taq полимераза (рис.3) в честь термостабильной бактерии, из которой она была выделена (Thermus aquaticus)
T. aquaticus обитает в горячих гидротермальных источниках. Ее ДНК-полимераза очень устойчива к повышенным температурам и наиболее активна при температуре около 70 °\text C70°C70, °, start text, C, end text (температура, при которой ДНК-полимераза человека или кишечной палочки перестают функционировать). Эта термостойкость делает Taq-полимеразу идеальной для ПЦР. Как мы увидим позже, высокая температура неоднократно используется в ПЦР для денатурации ДНК-матрицы или для разделения ее цепей.
Ход реакции
1
Денатурация
Спираль ДНК в пробе нагревается на период от половины до двух минут на 94-96 градусов. Под воздействием высоких температур цепи ДНК распадаются на отдельные фрагменты
2
Отжиг
Вылавливаются необходимые фрагменты с помощью праймеров и сплавляются. Эта стадия проходит при температуре немного ниже, на 4-5 градусов. Продолжительность стадии так же варьируется от половины до двух минут
3
Элонгация
Добавляется специальный фермент для запуска самовоспроизводства (синтеза) «пойманного» участка генов – ДНК-полимераза. И этот фермент запускает реакцию удваивания фрагмента, используя стартовый фрагмент, как матрицу для синтезирования копии. Протекает реакция при 72 градусов от 10 до 12 минут.
Обычно одно исследование составляет от 20 до 35 подобных циклов
Обычно одно исследование составляет от 20 до 35 подобных циклов
Термоциклеры
специализированный лабораторный прибор для проведения процесса полимеразной цепной реакции (ПРЦ).
Каждый цикл работы амплификатора позволяет копировать фрагмент ДНК; прибор проводит тысячи однотипных циклов. Для того, чтобы копирование было как можно более точным, изменения температуры происходят максимально быстро.
Термоциклер проводит серию (циклы) нагреваний/охлаждений, причем пользователь сам устанавливает длительность цикла и температурные параметры. Преимущество прибора в том, что изменения температуры происходит за секунды (от 2 до 10 градусов за секунду). Точность поддержания температуры на заданном уровне обычно составляет от 0,1 до 0,5 градуса. Прибор работает одновременно с несколькими десятками пробирок, есть планшетные системы, рассчитанные на 96 и даже 384 лунки. При этом, все пробирки, расположенные хоть в центре, хоть с краев термоблока, нагреваются/охлаждаются одинаково (если не используется градиентный нагрев по ширине блока).
Термоциклер проводит серию (циклы) нагреваний/охлаждений, причем пользователь сам устанавливает длительность цикла и температурные параметры. Преимущество прибора в том, что изменения температуры происходит за секунды (от 2 до 10 градусов за секунду). Точность поддержания температуры на заданном уровне обычно составляет от 0,1 до 0,5 градуса. Прибор работает одновременно с несколькими десятками пробирок, есть планшетные системы, рассчитанные на 96 и даже 384 лунки. При этом, все пробирки, расположенные хоть в центре, хоть с краев термоблока, нагреваются/охлаждаются одинаково (если не используется градиентный нагрев по ширине блока).
Устройство прибора
- корпус
- термоблок (рис.), как правило, снабженной нагревательным элементом
- крышка регулируемая по высоте, чтобы пробирка была полностью погружена во внутренний блок и в ее верхней части не скапливался конденсат
- охлаждающих термоэлектрических элементов, основанных на принципе Пельтье (физический принцип возникновения разницы температур при протекании тока через контакт двух разных полупроводниковых материалов)
- нагревательные элементы
- вентиляторы
- радиаторы
- микропроцессор
- экран для вывода результатов и сообщений о состоянии процесса ПЦР
- клавиатура для ввода параметров процесса и его программирования
Термоблок амплификатора с пробирками
Термоблок
служит для фиксации реакционных сосудов и обеспечения передачи тепла. В качестве реакционных сосудов как правило используются пробирки в том или ином исполнении.
В практике наиболее часто используются одноразовые пластиковые пробирки объёмом 0,2 мл в виде отдельных пробирок, стрипов по 8 пробирок и 96-луночных планшетов.
В практике наиболее часто используются одноразовые пластиковые пробирки объёмом 0,2 мл в виде отдельных пробирок, стрипов по 8 пробирок и 96-луночных планшетов.
Типы термоблоков
Твердотельный
представляет собой блок из сплава с высокой теплопроводностью с углублениями под реакционные сосуды, распространены шире
Роторный
роторный только фиксирует пробирки, термостатирование воздушное
Основные требования к термоблоку — высокая теплопроводность и однородность температуры, достигающая в лучших моделях 0,1 °C.
В современных моделях крышка термоблока оснащается нагревателем («горячая крышка», Hotlid) для предотвращения испарения реакционной смеси. Крышка имеет механический прижим для обеспечения плотного контакта реакционных сосудов с термоблоком и «горячей крышкой», часто регулируемый для использования с расходными материалами различной высоты. Управление регулируемым прижимом ручное или автоматизированное электромеханическое. Существует два основных варианта исполнения крышки термоблока — откидная и выдвижной термоблок (напоминает лоток CD-привода) с крышкой, размещённой внутри прибора.
Откидной (слева) и выдвижной (справа) типы амплификаторов
Система термостатирования амплификатора
Термостатирование в современных амплификаторах производится с помощью элементов Пельтье с радиатором и вентилятором, что обеспечивает наибольшую скорость изменения температуры и меньшую зависимость от комнатной температуры, также надёжность и компактность за счёт упрощения конструкции.
Система управления амплификатора
Система управления основана на встроенном микрокомпьютере и осуществляет контроль температурного режима согласно программе амплификации. Управление температурным режимом производится на основе показаний термодатчиков в термоблоке и математической модели, позволяющей точно выходить на заданную температуру, быстро стабилизировать её и обеспечивать равномерность температуры по термоблоку. Пользовательский интерфейс прибора состоит из алфавитно-цифрового или графического дисплея и клавиатуры. При запуске программы амплификации дисплей отображает название программы, текущий шаг, установленную и реальную температуру реакционной смеси. В случае использования графического дисплея производится более наглядное отображение шагов программы в виде диаграммы.
Современные амплификаторы высокого класса оснащаются цветными сенсорными дисплеями высокого разрешения с интерфейсами (рис.6), аналогичными интерфейсам мобильных устройств и рядом сервисных функций. Обычно имеется возможность подключения к внешнему компьютеру для управления амплификатором с него и ведения журналов работы.
Амплификаторы начального уровня могут не иметь встроенного пользовательского интерфейса и управляться только с внешнего компьютера.
Возможность проведения ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR)
Амплификатор оснащается детектором флуоресценции, регистрирующим флуоресцентный сигнал (рис.7) от реакционной смеси для построения графика накопления продукта ПЦР. В приборах с твердотельным термоблоком детекция производится сверху через крышку пробирки, на качество могут влиять особенности реакционных сосудов, в амплификаторах с роторным термоблоком через нижнюю часть пробирки, что является предпочтительным ввиду минимальной толщины и повышенной прозрачности стенки пробирки. Амплификаторы с роторным термоблоком, как правило, выпускаются только в исполнении для ПЦР в реальном времени.
Схема строение термоблока амплификатора
- термоблок - для быстрого нагрева реакционных пробирок
- теплоотвод – для быстрого охлаждения реакционных пробирок
- коаксиальное оптоволокно – для передачи флуоресцентного сигнала с реакционных пробирок на детектирующее устройство
- шаговый двигатель – перемещение пробирок или фильтров на определенное расстояние, заданное программой
- фильтры – регистрация флуоресцентного сигнала определенной длины волны.
Как выбрать амплификатор для ПЦР лаборатории?
При выборе прибора следует учесть его основные параметры:
1
температурная однородность нагрева всех пробирок и точность задания температуры; чем лучше эти характеристики, тем точнее результаты
2
скорость нагревания/охлаждения; высокая скорость сокращает временные затраты сотрудников и лаборатории в целом
3
температурный диапазон
4
вместимость отсека для пробирок и варианты размера пробирок; возможность работы с пробирками по 0,1 мл позволяет экономить на количестве добавляемых реагентов, снижает себестоимость анализа, увеличивает число одновременно обрабатываемых пробирок
5
количество программ
Кроме основных характеристик стоит обратить внимание на простоту программирования прибора, тип и размер информационного дисплея, а также, какая информация и в каком виде выводится на экран. Выпускаются амплификаторы со сменными блоками, с адаптерами для установки пробирок разного размера или микропланшет; приборы, на основе которых можно создавать полностью автоматизированные ПЦР-станции
Применение
В криминалистике фрагменты ДНК, взятые с места преступления, многократно копируют и потом сравнивают с ДНК подозреваемого
При установлении отцовства можно выяснить степень родства
Прибор позволяет проследить эволюцию родственных организмов в биологии и антропологии.
В медицине — значительно сокращаются сроки диагностики и выявления различных наследственных, вирусных, бактериальных, паразитарных заболеваний. Например, в группе риска можно выявить носителя заболевания почти сразу после заражения, до момента (иногда за месяцы) проявления первых симптомов. Для диагностики возбудителя достаточно нескольких молекул его ДНК
Определение генетической предрасположенности к непереносимости конкретного лекарственного препарата.
Для получения нужных белков или производных РНК в промышленных масштабах для нужд фармацевтики, медицины, сельского хозяйства. Для этого выделяется нужный ген ДНК, копируется и встраивается в другой организм, который и производит нужные белки
В пищепроме выявляют в продуктах питания наличие ГМО; проводят анализы на наличие патогенных микроорганизмов в продуктах, в смывах с оборудования
Температурные режимы амплификации
Денатурация
Температура денатурации составляет 94-95 °С, время денатурации - 15 - 60 с.
При неполной денатурации выход продукта уменьшен. В то же время
неоправданно длительная денатурация вызывает снижение активности фермента.
При неполной денатурации выход продукта уменьшен. В то же время
неоправданно длительная денатурация вызывает снижение активности фермента.
Отжиг праймеров
Температура и время, требующиеся для отжига праймеров, зависят от состава оснований, длины и концентрации праймеров.
Если при данной температуре не обеспечивается требуемая специфичность реакции, температуру отжига повышают.
Если при данной температуре не обеспечивается требуемая специфичность реакции, температуру отжига повышают.
Элонгация
Время достраивания зависит от длины и концентрации мишеневой последовательности и от температуры. Температура обычно варьирует в диапазоне 70 - 75 °С, традиционно составляя 72 °С (эта температура близка к оптимальной для экстензии праймеров для амплификации модельной матрицы, основанной на фаге М13). Скорость инкорпорации нуклеотидов при 72 °С составляет от 35 до 100 нуклеотидов в секунду, в зависимости от состава буфера, pH, концентрации солей, природы матрицы ДНК.
Для некоторых последовательностей предпочтительным является двухфазный цикл, при котором температуры отжига и экстензии совпадают.
Целесообразно продлевать время экстензии на ранних стадиях ПЦР при малых количествах ДНК и в конце цикла, когда концентрация продукта значительно превышает концентрацию фермента.
Удлиненная последняя экстензия (5 - 10 мин) обеспечивает полную ренатурацию цепей ДНК
Целесообразно продлевать время экстензии на ранних стадиях ПЦР при малых количествах ДНК и в конце цикла, когда концентрация продукта значительно превышает концентрацию фермента.
Удлиненная последняя экстензия (5 - 10 мин) обеспечивает полную ренатурацию цепей ДНК
Изменение температуры в типичном трехступенчатом цикле ПЦР
Обычно амплификацию проводят в течение 30 - 35 циклов. Распространенной ошибкой является выполнение излишнего количества циклов, что ведет к появлению неспецифических продуктов.
Параметры циклов амплификации в значительной степени зависят от системы и особенностей амплификатора. Например, прибор "GeneAmp PCR System 9600" фирмы "Perkin Elmer", который имеется во многих экспертно-криминалистических лабораториях органов внутренних дел, оснащен специальной крышкой, плотно закрывающей плату с ячейками. Благодаря этому происходит равномерное и быстрое прогревание всей пробирки (включая ее крышку) и содержимое пробирки не конденсируется на внутренней поверхности. Это дает возможность работать без минерального масла, а также использовать короткие циклы амплификации. Последнее достигается также за счет использования специальных тонкостенных пробирок, значительно сокращающих время прогревания.
В настоящее время выпускается большое количество моделей амплификаторов, в том числе отечественного производства.
В настоящее время выпускается большое количество моделей амплификаторов, в том числе отечественного производства.
Требования к амплификатору
прибор должен обеспечивать непрерывность циклов в заданном режиме;
скорость охлаждения должна составлять не более 1 град/с, нагревания - не более 1,5 град/с
отсчет времени должен начинаться при достижении заданной температуры
разница температур в разных ячейках должна быть минимальной
Необходимо быть уверенным, что температура, которая высвечивается на дисплее амплификатора, соответствует температуре содержимого пробирок. У многих систем амплификаторов на дисплее высвечивается температура платы, при этом температура амплификационной смеси может значительно от нее отличаться. Поэтому, приступая к работе на новом приборе, следует провести контрольное измерение температуры в ячейках. Если реальная температура ниже температуры на дисплее и не удается провести корректировку показаний дисплея, необходимо задавать более высокую температуру, чем указано по методике, и контролировать режим работы амплификатора с помощью термометра.
В качестве термометра рекомендуется использовать специальный датчик, позволяющий измерять температуру непосредственно в пробирке, помещенной в ячейке платы. Пробирка должна быть того же образца, который используется при проведении амплификации.
Следует также измерить температуру в разных ячейках платы и, если она существенно различается, использовать те ячейки, в которых температура наиболее близка к заданной. Пробы, относящиеся к одной и той же экспертизе, а также все контрольные пробы необходимо помещать в ячейки с одинаковой температурой.
В качестве термометра рекомендуется использовать специальный датчик, позволяющий измерять температуру непосредственно в пробирке, помещенной в ячейке платы. Пробирка должна быть того же образца, который используется при проведении амплификации.
Следует также измерить температуру в разных ячейках платы и, если она существенно различается, использовать те ячейки, в которых температура наиболее близка к заданной. Пробы, относящиеся к одной и той же экспертизе, а также все контрольные пробы необходимо помещать в ячейки с одинаковой температурой.
Амплификаторы закрытого и открытого типа
Приступая к работе на новом амплификаторе, необходимо провести оптимизацию условий ПЦР.
Наиболее распространенные модели амплификаторов относятся к категории открытых приборов, то есть большинство производителей наборов реагентов осуществило адаптацию своей продукции к этому оборудованию. Закрытые приборы позволяют реализовать только тот перечень исследований, который определен их производителем (он же, как правило, является и производителем наборов реагентов).
Важной характеристикой открытых приборов является возможность использования для ПЦР-анализа широкого спектра расходных материалов: одиночные и стрипованные микропробирки с выпуклой или плоской крышками, микропланшеты для ПЦР разных производителей. В данном случае преимуществом обладают те амплификаторы, в функционал которых входит возможность настройки термоблока по высоте пробирок – измерение высоты пробирок рекомендуется производить при переходе на другой тип пробирок или стрипов, при возникновении сомнения в качестве прижима пробирок «горячей крышкой».
Наиболее распространенные модели амплификаторов относятся к категории открытых приборов, то есть большинство производителей наборов реагентов осуществило адаптацию своей продукции к этому оборудованию. Закрытые приборы позволяют реализовать только тот перечень исследований, который определен их производителем (он же, как правило, является и производителем наборов реагентов).
Важной характеристикой открытых приборов является возможность использования для ПЦР-анализа широкого спектра расходных материалов: одиночные и стрипованные микропробирки с выпуклой или плоской крышками, микропланшеты для ПЦР разных производителей. В данном случае преимуществом обладают те амплификаторы, в функционал которых входит возможность настройки термоблока по высоте пробирок – измерение высоты пробирок рекомендуется производить при переходе на другой тип пробирок или стрипов, при возникновении сомнения в качестве прижима пробирок «горячей крышкой».
Емкость термоблока (количество лунок в термоблоке) – важная характеристика при определении объема лабораторных исследований, которые необходимо провести за единицу времени. В данном случае необходимо рассчитать количество пробирок с РС, необходимое для анализа образцов, с учетом ПКО, ОКО, стандартов или калибраторов (в случае количественной ПЦР), дублей (если это предусмотрено технологией), которые будут амплифицироваться одномоментно. Кроме того, следует обратить внимание на возможность совмещения нескольких разных тестов при одном запуске прибора (программа амплификации должна быть единой для выбранного перечня).
В большинстве своем термоблоки амплификаторов с детекцией результатов в режиме реального времени рассчитаны на 96 пробирок. При значительных потоках лабораторных исследований или на этапе планирования увеличения пропускной способности лаборатории целесообразнее рассмотреть варианты приобретения 384-луночных приборов с возможностью автоматизации процесса составления РС и внесения выделенной НК. При малой пропускной способности лаборатории, напротив,
экономически выгоднее и эргономичнее, с точки зрения рутинной работы, приборы с 48-луночными термоблоками. Причем наличие двух и более приборов с малой емкостью термоблока позволяет совмещать за единицу времени несколько тестов с разными программами амплификации, что дает возможность небольшим лабораториям поддерживать широкий перечень исследований при максимальной эффективности использования амплификаторов.
экономически выгоднее и эргономичнее, с точки зрения рутинной работы, приборы с 48-луночными термоблоками. Причем наличие двух и более приборов с малой емкостью термоблока позволяет совмещать за единицу времени несколько тестов с разными программами амплификации, что дает возможность небольшим лабораториям поддерживать широкий перечень исследований при максимальной эффективности использования амплификаторов.
Каналы детекции
Наиболее часто оптическая система амплификаторов для детекции результатов в режиме реального времени включает четыре-шесть каналов детекции. Соответственно, для 4-канальных приборов максимально возможный мультиплексный вариант – три искомых мишени (например, три возбудителя) + ВК, детектируемые в одной пробирке. Для 6-канальных приборов возможно использование мультиплексов на пять мишеней + ВК. Увеличение числа каналов детекции сопряжено со значительным удорожанием наборов реагентов за счет введения дополнительных флуорофоров и снижением качества регистрации флуоресценции по причине «кросс-токов» (перекрестных сигналов между каналами детекции).
При кажущейся внешней простоте, ПЦР является сложной многокомпонентной и многофакторной системой со всеми вытекающими отсюда последствиями.
Влияние различных компонентов ПЦР на конечный результат амплификации
Компоненты/факторы
Вода
Степень влияния
Низкая
Комментарии
Любая вода, начиная от самого обычного дистиллята может быть использована для проведения ПЦР. Основная проблема связана с возможными микробиологическими загрязнениями (проростами разного рода), которые иногда не сразу становятся заметными.
Реакционный буфер
Низкая
Состав буферов, в большинстве случаев, незначительно влияет на результативность ПЦР. Должны быть соблюдены основные требования к буферу: поддержание рН, ионы щелочных металлов. рН буфера часто играет существенную роль. Обычно, большинство ферментов хорошо работают в буферах с рН8-9.5.
Ионы Mg2+
Высокая
Правильно подобранная концентрация ионов Mg2+ фактически определяет эффективность и результативность ПЦР. Титрование магния - первое, с чего необходимо начинать отработку метода для конкретной ПЦР. При изменении любого компонента реакционной системы (новая партия праймеров, новая партия трифосфатов, новый фермент, новый прибор, новые условия реакции) необходимо заново проводить титрование.
Минеральное масло
Низкая
Если для предотвращения испарения реакционной смеси в процессе реакции применяется минеральное масло, следует проверить новую партию масла на наличие ингибирующих компонентов. Редко, но ингибирование за счет примесей в масле встречается.
Трифосфаты
Средняя
Проблемы с трифосфатами имеют несколько причин:
- разрушение трифосфата (как правило, до дифосфата)
- разная концентрация индивидуальных трифосфатов
- посторонние ингибирующие примеси. Проблемы с трифосфатами случаются не очень часто и проявляются в увеличении количества неспецифического продукта, а также в снижении выхода конечного продукта или полного его отсутствия.
Праймеры
Высокая
Правильно подобранный праймер решает все! Существует огромное количество публикаций и рекомендаций.
Основные наши рекомендации:
Основные наши рекомендации:
- праймер должен быть по возможности коротким
- быть равномерным по G/C:A/T составу
- не иметь на 3'-конце G/C богатого участка
Матрица (биологический материал, содержащий исходную ДНК/РНК)
Высокая
Важно, как количество, так и качество матрицы. Притом, недостаток матрицы в реакционной смеси редко является проблемой, а избыток приводит к наработке большого количества неспецифических продуктов. Качество матрицы часто определяется источником, из которого данная матрица выделяется. Некоторые характерные для конкретного источника компоненты могут ингибировать ПЦР.
Фермент
Высокая
Все ферменты разные! Все ферменты проявляют себя по-разному в разных амплификационных системах. Предугадать, какой фермент где и как себя поведет - невозможно. Хотя и есть некоторые предпосылки, которые позволяют делать отдельные прогнозы, мы рекомендуем - подбирайте исходя из результатов предварительного теста.
Добавочный компоненты (DMSO, DMF, бетаин, глицерин и др.)
От низкой до средней
Возможностей улучшать то, что плохо работает, всегда много. Наши рекомендации - оставьте применение добавочных компонентов на самыйсамый крайний случай. Обязательно посоветуйтесь с кем-нибудь, кто применял подобные добавки. Если человек сам не применял, а только слышал, не верьте такому совету - вы только зря потратите время и усилия
Температура отжига
Высокая
Как и в случае с магнием, температура отжига должна подбираться экспериментально. Никаких теоретических расчетов! Каждый прибор, каждая пара праймеров, каждое изменение в компоненте реакционной смеси требует подбора температуры отжига.
Амплификатор
Средняя
Каждый амплификатор имеет свой алгоритм набора температуры, скорость перехода температуры, мощность нагрева. На каждом приборе требуется подбор температурных и временных условий под конкретную систему амплификации. Возможно, потребуется изменение в количестве магния или других компонентов.
Пластик
Низкая
Качество пробирок для проведения реакции - коварная штука. Пластик может отличаться по толщине стенки - влияет на скорость прогрева и, как результат, на специфичность и эффективность ПЦР. Наиболее опасна ситуация, когда пластик содержит остатки мономеров. Это очень высоко реакционные химические соединения, которые, в зависимости от вида полимера, могут связывать компоненты реакционной смеси, либо выделяться в раствор в ходе реакции и ингибировать процесс
Техника «Горячий старт» в ПЦР и его преимущества
На сегодняшний день в технологии генно-молекулярных исследований разработаны варианты постановки ПЦР, направленные на решение следующих задач:
- увеличение эффективности ПЦР реакции;
- снижение риска образования неспецифических продуктов;
- проведение качественного и количественного анализа искомых участков молекулы ДНК/РНК.
Несмотря на широкие возможности модификации условий ПЦР, всегда найдутся неучтенные причины, которые приводят к невозможности получения удовлетворительного результата.
Часто встречающаяся проблема - образование праймер-димеров и, как результат, снижение количества нарабатываемого специфического продукта и чувствительности метода. Более сложно устранимые проблемы - неспецифический отжиг праймеров. В таких случаях увидеть продукт часто вообще не удается. Причина этих проблем - еще на стадии подготовки реакционной смеси при комнатной температуре отдельные участки праймеров неспецифически отжигаются на фрагментах матрицы или друг на друге с последующей элонгацией ферментом и образованием неспецифических "ложных" матриц.
Хотя считается, что Taq полимераза работает при температуре 62-72 °С, на самом деле при комнатной температуре активность фермента тоже достаточно высокая, что способствует появлению неспецифических продуктов еще до того, как пробирка с реакционной смесью будет помещена в амплификатор для проведения ПЦР.
Принимая во внимание такую возможность возникновения проблемы, многие исследователи, а следом за ними и производители продукции для молекулярной биологии, стали разрабатывать методы, которые позволяют предотвратить до-ПЦР образование неспецифических продуктов.
Самый простой и очевидный способ предлагал внесение фермента в уже нагретую до температуры полной денатурации ДНК (94 °С ) реакционную смесь. Позже на стадии денатурации пробовали вносить трифосфаты, магний, праймеры.
Таким образом, внесение компонента, без которого невозможна элонгация цепи, осуществляемого на стадии денатурации (нагрева), стали называть "горячим стартом" (hot start). К сожалению, становятся известными в основном удачные результаты использования таких подходов. Результаты экспериментов, которые не дали привели к решению проблемы, как правило, не публикуют. Преобладание статей, где результат оказался положительным и послужило причиной считать "горячий старт" панацеей от всех проблем, связанных с ПЦР.
Часто встречающаяся проблема - образование праймер-димеров и, как результат, снижение количества нарабатываемого специфического продукта и чувствительности метода. Более сложно устранимые проблемы - неспецифический отжиг праймеров. В таких случаях увидеть продукт часто вообще не удается. Причина этих проблем - еще на стадии подготовки реакционной смеси при комнатной температуре отдельные участки праймеров неспецифически отжигаются на фрагментах матрицы или друг на друге с последующей элонгацией ферментом и образованием неспецифических "ложных" матриц.
Хотя считается, что Taq полимераза работает при температуре 62-72 °С, на самом деле при комнатной температуре активность фермента тоже достаточно высокая, что способствует появлению неспецифических продуктов еще до того, как пробирка с реакционной смесью будет помещена в амплификатор для проведения ПЦР.
Принимая во внимание такую возможность возникновения проблемы, многие исследователи, а следом за ними и производители продукции для молекулярной биологии, стали разрабатывать методы, которые позволяют предотвратить до-ПЦР образование неспецифических продуктов.
Самый простой и очевидный способ предлагал внесение фермента в уже нагретую до температуры полной денатурации ДНК (94 °С ) реакционную смесь. Позже на стадии денатурации пробовали вносить трифосфаты, магний, праймеры.
Таким образом, внесение компонента, без которого невозможна элонгация цепи, осуществляемого на стадии денатурации (нагрева), стали называть "горячим стартом" (hot start). К сожалению, становятся известными в основном удачные результаты использования таких подходов. Результаты экспериментов, которые не дали привели к решению проблемы, как правило, не публикуют. Преобладание статей, где результат оказался положительным и послужило причиной считать "горячий старт" панацеей от всех проблем, связанных с ПЦР.
Как работает "горячий старт"
Как уже отмечалось выше, основная причина, с которой должен бороться "горячий старт", неспецифический отжиг праймеров и наработка неспецифического продукта на первых стадиях ПЦР. Что же происходит, если полимераза (или другой ключевой компонент реакционной системы) вносится, когда ДНК и праймеры находятся в денатурированном состоянии? А происходит то, что праймеры не могут отжечься на матрице, наработка какого-либо продукта не происходит. Далее температура начинает снижаться к температуре отжига. Как только возникает ситуация, когда праймер имеет термодинамическую возможность отжечься на матрице, отжиг совершается и начинается наработка продукта.
Как уже отмечалось выше, основная причина, с которой должен бороться "горячий старт", неспецифический отжиг праймеров и наработка неспецифического продукта на первых стадиях ПЦР. Что же происходит, если полимераза (или другой ключевой компонент реакционной системы) вносится, когда ДНК и праймеры находятся в денатурированном состоянии? А происходит то, что праймеры не могут отжечься на матрице, наработка какого-либо продукта не происходит. Далее температура начинает снижаться к температуре отжига. Как только возникает ситуация, когда праймер имеет термодинамическую возможность отжечься на матрице, отжиг совершается и начинается наработка продукта.
Связь праймера с матрицей определяются следующими факторами:
Температура
определяет термодинамическое перемещение компонентов реакционной смеси, включая праймеры и матрицу, и определяет, какое усилие требуется праймеру для удержания на матрице.
При более высокой температуре шанс отжечься на матрице имеет праймер только с очень высокой степенью гомологии
При более высокой температуре шанс отжечься на матрице имеет праймер только с очень высокой степенью гомологии
Концентрация ионов магния
связываясь посредством ионных сил с основаниями, создают заряд определенной силы, влияющий на прочность удержания праймера на матрице. Чем выше концентрация ионов магния, тем выше стабильность образования праймер:матрица, чем ниже концентрация ионов магния, тем ниже стабильность отжига, тем больше шансов для отжига праймера с высокой степенью гомологии.
Состав праймера G/C
A/T состав праймера определяет прочность связи праймера с матрицей. Праймер с высоким G/C может связаться и удерживаться на матрице за счет высокой энергии связи между G:C парами. Шанс получить неспецифический отжиг катастрофически возрастает.
Разновидности «горячего старта» и их эффективность
Метод
Внесение компонентов на стадии денатурации (фермент, dNTP, магний)
Эффективность горячего старта
От средней до высокой
Комментарии
Компоненты могут вноситься как непосредственно в разогретую смесь, так и способом разделительных барьеров (маслá или парафины, которые плавятся при нагреве, позволяя компонентам смешаться только на стадии денатурации). Основной недостаток этого метода - дополнительные манипуляции.
Изоляция отдельных компонентов реакционной смеси внутри самой смеси
Высокая
Большинство этих методов использует чувствительные к нагреванию материалы (капсулы из воска или агарозы, содержащие фермент или магний, высвобождающиеся при нагревании) или другие способы связать один из компонентов реакционной смеси, постепенно высвобождая его в ходе реакции. Недостаток этого метода - дополнительные манипуляции.
Использование антител или олигонуклеотидных последовательностей (аптамеры) для блокирования активности полимеразы
От низкой до средней
Удобный метод. Основной его недостаток - температура денатурации комплекса "блокировки" полимеразы часто составляет 45-55 °С, что не всегда мешает полимеразе успеть наработать неспецифические продукты. Другим недостатком, в случае с использованием антител, является возможность контаминации ДНК, оставшейся после очистки антител.
Химическая модификация полимеразы
Высокая
Очень эффективный метод. Удобно использовать. Недостатки: - активность фермента уменьшается с течением времени; - как правило, требуется использование специального буфера, не всегда оптимального для применяемой системы; - результативная активность полимеразы на практике оказывается ниже аналогичной не-модифицированной полимеразы, как результат, увеличение количества циклов; - эффективная для коротких (до 500 п.н.) фрагментов, полимераза может быть неэффективна для получения более длинных фрагментов (свыше 500 п.н.)
Защищенный на 3'-конце праймеры
Экспериментальный, не известно
Новый метод. Идея заключается в использовании на 3'-конце праймера термолабильную защиту, препятствующая элонгации и которая разрушается на стадии денатурации
Методы детекции в ПЦР анализе
Электрофоретический
в агарозном или полиакриламидном геле
Гибридизационно-ферментный
Гибридизационно-флуоресцентный
- регистрация продукта после окончания реакции амплификации «анализ по конечной точке"
- детекция продукта в режиме реального времени
Метод гель-электрофореза
Наиболее распространенным до недавнего времени являлся метод электрофореза, основанный на разделении молекул ДНК по размеру. В этом случае визуализацию результатов проводят в пластине агарозного геля, который представляет собой застывшую после расплавления в электрофорезном буфере агарозу в концентрации 1,5–2,5 % с добавлением специального красителя ДНК, например, бромистого этидия.
Застывшая агароза образует пространственную решетку. При заливке с помощью гребенок в геле формируют лунки, в которые вносят продукты амплификации. Пластину геля помещают в аппарат для горизонтального гель-электрофореза и подключают источник постоянного напряжения. Отрицательно заряженная ДНК начинает двигаться в геле от минуса к плюсу. При этом более короткие молекулы ДНК движутся быстрее, чем длинные. На скорость движения ДНК в геле влияют: концентрация агарозы, напряженность электрического поля, температура, состав электрофорезного буфера и, в меньшей степени, ГЦ-состав ДНК.
Застывшая агароза образует пространственную решетку. При заливке с помощью гребенок в геле формируют лунки, в которые вносят продукты амплификации. Пластину геля помещают в аппарат для горизонтального гель-электрофореза и подключают источник постоянного напряжения. Отрицательно заряженная ДНК начинает двигаться в геле от минуса к плюсу. При этом более короткие молекулы ДНК движутся быстрее, чем длинные. На скорость движения ДНК в геле влияют: концентрация агарозы, напряженность электрического поля, температура, состав электрофорезного буфера и, в меньшей степени, ГЦ-состав ДНК.
Краситель встраивается (интеркалирует) плоскостными группами в молекулы ДНК. Все молекулы одного размера движутся с одинаковой скоростью. После окончания электрофореза, продолжающегося от 10 минут до 1 часа, гель помещают на фильтр трансиллюминатора, который излучает свет в ультрафиолетовом диапазоне (254–310 нм). Энергия ультрафиолета, поглощаемая ДНК в области 260 нм, передается на краситель, заставляя его флуоресцировать в оранжево-красной области видимого спектра (590 нм).
Яркость полос продуктов амплификации может быть различной, поэтому часто в ПЦР-лабораториях принято оценивать результат по трех-, четырех- или пятибалльной системе. Однако, как уже отмечалось ранее, это нельзя связывать с начальным количеством ДНК-мишени в образце. Часто уменьшение яркости свечения полос связано со снижением эффективности амплификации под влиянием ингибиторов или других факторов.
Яркость полос продуктов амплификации может быть различной, поэтому часто в ПЦР-лабораториях принято оценивать результат по трех-, четырех- или пятибалльной системе. Однако, как уже отмечалось ранее, это нельзя связывать с начальным количеством ДНК-мишени в образце. Часто уменьшение яркости свечения полос связано со снижением эффективности амплификации под влиянием ингибиторов или других факторов.
Метод вертикального электрофореза принципиально схож с горизонтальным электрофорезом. Их отличие заключается в том, что в данном случае вместо агарозы используют полиакриламид и специальную камеру для вертикального электрофореза.
Электрофорез в полиакриламидном геле имеет большую разрешающую способность по сравнению с агарозным электрофорезом и позволяет различать молекулы ДНК с точностью до одного нуклеотида. Однако приготовление полиакриламидного геля несколько сложнее агарозного, кроме того, акриламид является токсичным веществом.
Поскольку необходимость определить размер продукта амплификации с точностью до 1 нуклеотида возникает редко, то в рутинной работе этот метод не используют.
Электрофорез в полиакриламидном геле имеет большую разрешающую способность по сравнению с агарозным электрофорезом и позволяет различать молекулы ДНК с точностью до одного нуклеотида. Однако приготовление полиакриламидного геля несколько сложнее агарозного, кроме того, акриламид является токсичным веществом.
Поскольку необходимость определить размер продукта амплификации с точностью до 1 нуклеотида возникает редко, то в рутинной работе этот метод не используют.
Оба варианта электрофоретической детекции позволяют осуществлять только качественный анализ и сопряжены с рядом проблем
Большие затраты времени на стадию детекции
Невозможность автоматизации
Сложности и субъективность трактовки результатов
Высокий риск контаминации и большие затраты на ее устранение
1. повышенные требования к организации лаборатории;
2. максимальное удаление зоны детекции от других зон проведения ПЦР;
3. выделение отдельного сотрудника на стадию детекции;
4. постоянный контроль смывов;
5. большое количество отрицательных контрольных образцов К- для контроля;
контаминации ампликонами, что приводит к увеличению объема расходных материалов и времени для подготовки к проведению детекции
2. максимальное удаление зоны детекции от других зон проведения ПЦР;
3. выделение отдельного сотрудника на стадию детекции;
4. постоянный контроль смывов;
5. большое количество отрицательных контрольных образцов К- для контроля;
контаминации ампликонами, что приводит к увеличению объема расходных материалов и времени для подготовки к проведению детекции
Флуоресцентные методы детекции
Флуоресцентные методы детекции построены на использовании флуорохромов – молекул, обладающих способностью к свечению в результате поглощения световой энергии. Детекция осуществляется специальными приборами
- после амплификации (ПЦР с анализом результатов по конечной точке)
- в процессеамплификации (ПЦР в режиме реального времени).
Технология позволяет минимизировать риск контаминации продуктами ПЦР и таким образом резко уменьшить число ложноположительных результатов. Также менее строгие требования предъявляются к организации ПЦР-лаборатории, становятся возможны автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов.
Технологии, которые получили коммерческую реализацию, используют интеркалирующие красители либо флуорофоры в составе олигонуклеотидных гибридизационных зондов.
- после амплификации (ПЦР с анализом результатов по конечной точке)
- в процессеамплификации (ПЦР в режиме реального времени).
Технология позволяет минимизировать риск контаминации продуктами ПЦР и таким образом резко уменьшить число ложноположительных результатов. Также менее строгие требования предъявляются к организации ПЦР-лаборатории, становятся возможны автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов.
Технологии, которые получили коммерческую реализацию, используют интеркалирующие красители либо флуорофоры в составе олигонуклеотидных гибридизационных зондов.
Интеркалирующие красители (лат. intercalatio – вставка, добавка) – молекулы, способные обратимо встраиваться (интеркалировать) между двумя комплементарными парами нуклеотидов в двуспиральной ДНК или РНК.
Наиболее распространенными интеркалирующими красителями (ИК) являются: EtBr, SYBR Green I, SYBR Gold, LCGreen, SYTO 9, Eva Green и другие.
Их преимущество – относительная дешевизна как самих красителей, так и наборов реагентов с их использованием. Однако есть существенный недостаток: способность связываться с любой двухцепочечной ДНК, появляющейся в реакционной смеси, которая может быть как целевым продуктом ПЦР, так и артефактом.
Поэтому для получения корректных результатов необходимо дополнительное изучение продуктов амплификации с помощью плавления ампликонов.
Кроме того, избыток SYBR Green I ингибирует активность Taq-полимеразы, что приводит к получению ложноотрицательных результатов ПЦР.
Наиболее распространенными интеркалирующими красителями (ИК) являются: EtBr, SYBR Green I, SYBR Gold, LCGreen, SYTO 9, Eva Green и другие.
Их преимущество – относительная дешевизна как самих красителей, так и наборов реагентов с их использованием. Однако есть существенный недостаток: способность связываться с любой двухцепочечной ДНК, появляющейся в реакционной смеси, которая может быть как целевым продуктом ПЦР, так и артефактом.
Поэтому для получения корректных результатов необходимо дополнительное изучение продуктов амплификации с помощью плавления ампликонов.
Кроме того, избыток SYBR Green I ингибирует активность Taq-полимеразы, что приводит к получению ложноотрицательных результатов ПЦР.
Принцип действия интеркалирующих красителей (например, SYBR Green)
ПЦР с анализом результатов по конечной точке (End-point PCR)
это модификация метода ПЦР, которая позволяет учитывать результаты реакции по наличию флуоресценции после амплификации.
Одним из таких вариантов является метод FLASH (FLuorescent Amplification-based Specific Hybridization) – специфическая гибридизация в процессе амплификации с ДНК-зондами, меченными флуорофорами.
Для проведения амплификации анализа результатов ПЦР FLASH используют специальное оборудование: термоциклеры и детекторы флуоресценции типа «Джин» и «Джин-4» производства компании ООО «НПО ДНК-Технология». В процессе своей работы прибор регистрирует флуоресцентное излучение, возникающее в реакционной смеси при освещении образца источником возбуждающего света. Регистрация производится последовательно для каждой из пробирок при ее позиционировании относительно оптического блока.
Метод позволяет проводить только качественный анализ, что существенно сокращает диагностические возможности лаборатории (определение вирусной нагрузки, анализ биоценозов), однако характеризуется простотой получения результата при невысоких затратах на оборудование и расходные материалы.
Одним из таких вариантов является метод FLASH (FLuorescent Amplification-based Specific Hybridization) – специфическая гибридизация в процессе амплификации с ДНК-зондами, меченными флуорофорами.
Для проведения амплификации анализа результатов ПЦР FLASH используют специальное оборудование: термоциклеры и детекторы флуоресценции типа «Джин» и «Джин-4» производства компании ООО «НПО ДНК-Технология». В процессе своей работы прибор регистрирует флуоресцентное излучение, возникающее в реакционной смеси при освещении образца источником возбуждающего света. Регистрация производится последовательно для каждой из пробирок при ее позиционировании относительно оптического блока.
Метод позволяет проводить только качественный анализ, что существенно сокращает диагностические возможности лаборатории (определение вирусной нагрузки, анализ биоценозов), однако характеризуется простотой получения результата при невысоких затратах на оборудование и расходные материалы.
ПЦР в режиме реального времени (Real-Time PCR, ПЦР-РВ)
используется для одновременной амплификации, детекции и (при необходимости) измерения количества искомой мишени . Преимуществом данного подхода является возможность количественного определения специфической последовательности НК в образце после каждого цикла амплификации.
Для анализа результатов ПЦР-РВ используют специальные ДНК-амплификаторы, например «ДТпрайм» или «ДТлайт» производства ООО «НПО ДНК-Технология», CFX (BioRad, США), COBAS Amplicor (Roche, США), АВI PRISM (ABI, США), Rotor-Gene (Qiagen, GmbH, Германия), SmartCycler и GeneXpert® System (Cepheid, США) и другие, с оптическим блоком, позволяющие детектировать флуоресценцию внутри реакционной пробирки в ходе амплификации.
Детектируемый флуоресцентный сигнал может состоять из трех последовательных участков:
1. базовая линия (сигнал не превышает предела детектирования прибора);
2. экспоненциальная амплификация;
3. плато.
Сигнал флуоресценции в ходе ПЦР возрастает пропорционально количеству продукта амплификации. Мониторинг сигнала позволяет построить кинетическую кривую реакции, при этом момент заметного увеличения сигнала и отрыва его от фонового – так называемый пороговый цикл – зависит от исходного количества ДНК-мишени. Чем больше количество ДНК в образце, тем раньше наблюдается начало роста сигнала флуоресценции и тем меньше пороговый цикл.
Для анализа результатов ПЦР-РВ используют специальные ДНК-амплификаторы, например «ДТпрайм» или «ДТлайт» производства ООО «НПО ДНК-Технология», CFX (BioRad, США), COBAS Amplicor (Roche, США), АВI PRISM (ABI, США), Rotor-Gene (Qiagen, GmbH, Германия), SmartCycler и GeneXpert® System (Cepheid, США) и другие, с оптическим блоком, позволяющие детектировать флуоресценцию внутри реакционной пробирки в ходе амплификации.
Детектируемый флуоресцентный сигнал может состоять из трех последовательных участков:
1. базовая линия (сигнал не превышает предела детектирования прибора);
2. экспоненциальная амплификация;
3. плато.
Сигнал флуоресценции в ходе ПЦР возрастает пропорционально количеству продукта амплификации. Мониторинг сигнала позволяет построить кинетическую кривую реакции, при этом момент заметного увеличения сигнала и отрыва его от фонового – так называемый пороговый цикл – зависит от исходного количества ДНК-мишени. Чем больше количество ДНК в образце, тем раньше наблюдается начало роста сигнала флуоресценции и тем меньше пороговый цикл.
Оборудование для ПЦР-РВ открывает широкий спектр возможностей:
Мультплексный качественный и количественный анализ
ОТ-ПЦР для измерения малых количеств мРНК, в том числе с количественной оценкой содержания искомой мРНК, определение уровня экспрессии гена в отдельной клетке или ткани
Технология плавления и другое
Плавление – двухэтапная технология ПЦР-РВ
когда на первом этапе осуществляется стандартная амплификация искомой мишени без детекции результатов накопления продукта амплификации, а на втором этапе происходит постепенное нагревание реакционной смеси, при котором двухцепочечный накопленный продукт денатурирует, то есть разделяется на одиночные нити ДНК. Флуоресцентная метка, связанная с двухцепочечной ДНК, при этом отделяется, и (в зависимости от вариантов реализации технологии плавления) детектируемая флуоресценция либо возрастает, либо убывает.
Составление протокола для амплификатора
Порядок действий при использовании амплификатора CFX96 (Bio-Rad, США)
Запуск эксперимента
1) Включить прибор и запустить программу Bio-Rad CFX Manager.
2) На панели инструментов нажать кнопку StartupWizard, выбрать пункт создания нового эксперимента Create a new Experiment, либо выбрать предыдущий эксперимент Repeat an Experiment и нажать кнопку ОК.
3) В окне постановки эксперимента Experimental setup, вкладка Protocol нажать кнопку Edit Selected для внесения изменений. Задать параметры амплификации в соответствии с программой амплификации используемого набора реагентов (обычно производители программу подробно прописывают в инструкции к набору реагентов) и сохранить протокол под новым именем.
4) Во вкладке Plate окна Experiment Setup создать или загрузить существующую схему расположения образцов в термоблоке. Анализируемые образцы обозначить Unknown, «К-» – Negative Control, «К+» – Positive Control. Для всех образцов задать измерение флуоресценции по каналам, указанным в пользовательской инструкции к набору.
5) Поместить пробирки в амплификатор.
6) Перейти во вкладку запуска реакции Start Run. Закрыть крышку амплификатора, запустить реакцию, нажав кнопку Start Run, сохранить файл с экспериментом.
Обработка полученных данных
1) По завершении реакции появится окно Data Analysis, в котором отобразятся результаты обработки графиков флуоресцентных кривых. Файл данных также может быть загружен путем нажатия кнопки Open a Data File на панели инструментов.
2) Выбрать режим определения значений пороговых циклов регрессионным анализом, нажав на панели инструментов Settings, из раскрывшегося меню выбрать C(t)Determination Mode/Regression. По завершении этих действий программа автоматически рассчитает значения пороговых циклов, при этом пороговая линия не будет отображаться.
3) Для анализа результатов можно выбрать как один, так и несколько каналов, при этом в нижней правой части окна программы отобразится таблица с результатами. При одновременном анализе нескольких каналов рекомендуется включить сортировку по флуорофору, нажав на заголовок столбца Fluor.
4) Перейти к этапу анализа результатов.
1) Включить прибор и запустить программу Bio-Rad CFX Manager.
2) На панели инструментов нажать кнопку StartupWizard, выбрать пункт создания нового эксперимента Create a new Experiment, либо выбрать предыдущий эксперимент Repeat an Experiment и нажать кнопку ОК.
3) В окне постановки эксперимента Experimental setup, вкладка Protocol нажать кнопку Edit Selected для внесения изменений. Задать параметры амплификации в соответствии с программой амплификации используемого набора реагентов (обычно производители программу подробно прописывают в инструкции к набору реагентов) и сохранить протокол под новым именем.
4) Во вкладке Plate окна Experiment Setup создать или загрузить существующую схему расположения образцов в термоблоке. Анализируемые образцы обозначить Unknown, «К-» – Negative Control, «К+» – Positive Control. Для всех образцов задать измерение флуоресценции по каналам, указанным в пользовательской инструкции к набору.
5) Поместить пробирки в амплификатор.
6) Перейти во вкладку запуска реакции Start Run. Закрыть крышку амплификатора, запустить реакцию, нажав кнопку Start Run, сохранить файл с экспериментом.
Обработка полученных данных
1) По завершении реакции появится окно Data Analysis, в котором отобразятся результаты обработки графиков флуоресцентных кривых. Файл данных также может быть загружен путем нажатия кнопки Open a Data File на панели инструментов.
2) Выбрать режим определения значений пороговых циклов регрессионным анализом, нажав на панели инструментов Settings, из раскрывшегося меню выбрать C(t)Determination Mode/Regression. По завершении этих действий программа автоматически рассчитает значения пороговых циклов, при этом пороговая линия не будет отображаться.
3) Для анализа результатов можно выбрать как один, так и несколько каналов, при этом в нижней правой части окна программы отобразится таблица с результатами. При одновременном анализе нескольких каналов рекомендуется включить сортировку по флуорофору, нажав на заголовок столбца Fluor.
4) Перейти к этапу анализа результатов.
Порядок действий при использовании амплификаторов
Rotor-Gene 3000/6000 (Corbett Research, Австралия), Rotor-Gene Q (Qiagen, Германия)
Запуск эксперимента
1) Включить прибор, запустить соответствующую программу.
2) Поместить пробирки в ротор амплификатора так, чтобы ротор был уравновешен, а первая пробирка была установлена в лунку 1.
3) Нажать кнопку New/Новый в основном меню программы.
4) В открывшемся окне перейти во вкладку Advanced/Детальный мастер и выделить Dual Labeled Probe/Hydrolysis probes/Флуоресцентные зонды (TaqMan). Нажать кнопку New/Новый.
5) В окне мастера создания протокола выбрать 36-well Rotor/36-луночный ротор и поставить галочку напротив пункта No Domned 0,2 ml Tubes/Locking Ring Attached/Кольцо закреплено. Нажать кнопку Next/Далее.
6) В открывшемся окне задать имя оператора и выбрать объем реакционной смеси Reaction volume/Объем реакции –в соответствии с инструкцией к набору реагентов. Нажать кнопку Next/Далее.
7) В открывшемся окне ввести температурный профиль амплификации. Для этого нажать Edit profile/Редактор профиля и задать параметры в соответствии с программой амплификации используемого набора реагентов (обычно производители программу подробно прописывают в инструкции к набору реагентов)
8) Задать измерение флуоресценции по каналам, соответствующим флуорофорам, указанным в пользовательской инструкции к набору.
9) В окне New Run Wizard/Мастер Нового Теста нажать кнопку Calibrate/Gain Optimization…/Опт.уровня сигн.
11) После запуска амплификации программа автоматически выводит окно мастера редактирования расположения пробирок в роторе. Задать расположение пробирок и их тип.
Обработка полученных данных
1) По завершении реакции в меню нажать кнопку Analysis/Анализ, во вкладке Quantitation выделить надпись Cycling A. FAM/Green и нажать кнопку Show/Показать.
2) Отменить автоматическое определение пороговой линии Threshold/Порог.
3) Установить пороговое значение флуоресценции Threshold/Порог = 0,03.
4) В меню основного окна нажать кнопки Slope Correct/Коррек.уклона, Dynamic Tube/Динамич. фон.
5) Нажать кнопку Outlier Removal/Устранение выбросов и установить значение NTC Threshold/Порог Фона - ПФ(NTC) равным 5%.
6) Если в окне с графиком не отображаются все кнопки с настройками, указанные в п. 4 и п. 5) можно расширить окно или раскрыть их, нажав кнопку со стрелками >>, расположенную в правом верхнем углу окна с графиком.
7) Программа автоматически рассчитывает значения пороговых циклов (Ct) для реакции амплификации по каналу FAM.
8) Провести расчет для остальных каналов аналогично FAM.
9) Перейти к этапу анализа результатов.
1) Включить прибор, запустить соответствующую программу.
2) Поместить пробирки в ротор амплификатора так, чтобы ротор был уравновешен, а первая пробирка была установлена в лунку 1.
3) Нажать кнопку New/Новый в основном меню программы.
4) В открывшемся окне перейти во вкладку Advanced/Детальный мастер и выделить Dual Labeled Probe/Hydrolysis probes/Флуоресцентные зонды (TaqMan). Нажать кнопку New/Новый.
5) В окне мастера создания протокола выбрать 36-well Rotor/36-луночный ротор и поставить галочку напротив пункта No Domned 0,2 ml Tubes/Locking Ring Attached/Кольцо закреплено. Нажать кнопку Next/Далее.
6) В открывшемся окне задать имя оператора и выбрать объем реакционной смеси Reaction volume/Объем реакции –в соответствии с инструкцией к набору реагентов. Нажать кнопку Next/Далее.
7) В открывшемся окне ввести температурный профиль амплификации. Для этого нажать Edit profile/Редактор профиля и задать параметры в соответствии с программой амплификации используемого набора реагентов (обычно производители программу подробно прописывают в инструкции к набору реагентов)
8) Задать измерение флуоресценции по каналам, соответствующим флуорофорам, указанным в пользовательской инструкции к набору.
9) В окне New Run Wizard/Мастер Нового Теста нажать кнопку Calibrate/Gain Optimization…/Опт.уровня сигн.
- задать калибровку по каналам соответствующим флуорофорам, указанным в пользовательской инструкции к набору. Для этого нажать кнопку Calibrate Acquiring/Optimise Acquiring/Опт. Детек-мых;
- задать калибровку перед первым измерением (Perform Calibration Before 1st Acquisition/ Perform Optimization Before 1st Acquisition/Выполнить оптимизацию при 1-м шаге детекции).
11) После запуска амплификации программа автоматически выводит окно мастера редактирования расположения пробирок в роторе. Задать расположение пробирок и их тип.
Обработка полученных данных
1) По завершении реакции в меню нажать кнопку Analysis/Анализ, во вкладке Quantitation выделить надпись Cycling A. FAM/Green и нажать кнопку Show/Показать.
2) Отменить автоматическое определение пороговой линии Threshold/Порог.
3) Установить пороговое значение флуоресценции Threshold/Порог = 0,03.
4) В меню основного окна нажать кнопки Slope Correct/Коррек.уклона, Dynamic Tube/Динамич. фон.
5) Нажать кнопку Outlier Removal/Устранение выбросов и установить значение NTC Threshold/Порог Фона - ПФ(NTC) равным 5%.
6) Если в окне с графиком не отображаются все кнопки с настройками, указанные в п. 4 и п. 5) можно расширить окно или раскрыть их, нажав кнопку со стрелками >>, расположенную в правом верхнем углу окна с графиком.
7) Программа автоматически рассчитывает значения пороговых циклов (Ct) для реакции амплификации по каналу FAM.
8) Провести расчет для остальных каналов аналогично FAM.
9) Перейти к этапу анализа результатов.
Порядок действий при использовании амплификатора LC96 (Roche, Германия)
Запуск эксперимента
1. Включить прибор и запустить программу LightCycler® 96.
2. Создать новый эксперимент, выполнив одно из действий:
4. Ввести протокол амплификации, для этого необходимо:
Negative Control, «К+» – Positive Control.
6. Во вкладке Sample Editor в окне Gene для каждого из каналов ввести названия мишеней ХХ и для внутреннего контроля - IC.
7. На панели инструментов нажать на значок Save Experiment чтобы сохранить новый эксперимент, откроется диалоговое окно Save As. Выбрать директорию для сохранения файла эксперимента, присвоить имя, нажать Save, при этом эксперимент сохранится в виде файла с расширением lc96.
8. Перенести файл эксперимента на прибор LightCycler® 96 с помощью USB накопителя или через локальную сеть, нажав на панели Tools/Instrument Manager и следуя указаниям руководства пользователя.
9. Поместить пробирки в амплификатор.
10. В меню прибора найти сохраненный эксперимент и запустить реакцию.
11. После завершения постановки первичные данные, полученные программой прибора, перенести в рабочую программу LightCycler® 96 на компьютер с помощью USB накопителя или через локальную сеть, нажав на панели Tools/Instrument Manager и следуя указаниям руководства пользователя.
Обработка полученных данных
1. Запустить файл завершенного эксперимента и провести анализ, нажав
2. Перейти во вкладку Analysis, на панели инструментов нажать кнопку Add Analysis ,в появившемся окне выбрать Qualitative detection и нажать OK, в появившемся следом окне также нажать ОК.
3. Нажать кнопку Analysis Settings . В появившемся окне для всех мишеней и ВКО задать значение Minimal EPF = 0.100
4. В таблице с результатами Result Table отобразятся предварительные результаты качественного анализа.
5. Программа автоматически рассчитает значения пороговых циклов Cq.
6. Перейти к этапу анализа результатов.
1. Включить прибор и запустить программу LightCycler® 96.
2. Создать новый эксперимент, выполнив одно из действий:
- В навигаторе запуска выбрать Create New Experiment, либо выбрать предыдущий эксперимент в качестве матрицы Create New Experiment from Existing.
- В панели меню инструментов кликнуть по значку lNew Experiment
4. Ввести протокол амплификации, для этого необходимо:
- в окне Programs нажать и выбрать последовательно все необходимые элементы протокола с подтверждением выбора нажатием кнопки Add, в столбце Cycles задать количество циклов.
- В окне Measurement задать объем реакции/Reaction Volume 30μl, нажав кнопку Detection Format задать измерение флуоресценции по каналам, указанным в пользовательской инструкции к набору, имеется 4 канала: FAM, Hex, Texas Red (эквивалент ROX) и Cy5.
- Выбирая элементы протокола в окне Steps ввести продолжительность и температуру шагов в окне Temperature справа, а также задать съем флуоресценции в окне Acquisition Mode, выбрав Single для соответствующего шага.
Negative Control, «К+» – Positive Control.
6. Во вкладке Sample Editor в окне Gene для каждого из каналов ввести названия мишеней ХХ и для внутреннего контроля - IC.
7. На панели инструментов нажать на значок Save Experiment чтобы сохранить новый эксперимент, откроется диалоговое окно Save As. Выбрать директорию для сохранения файла эксперимента, присвоить имя, нажать Save, при этом эксперимент сохранится в виде файла с расширением lc96.
8. Перенести файл эксперимента на прибор LightCycler® 96 с помощью USB накопителя или через локальную сеть, нажав на панели Tools/Instrument Manager и следуя указаниям руководства пользователя.
9. Поместить пробирки в амплификатор.
10. В меню прибора найти сохраненный эксперимент и запустить реакцию.
11. После завершения постановки первичные данные, полученные программой прибора, перенести в рабочую программу LightCycler® 96 на компьютер с помощью USB накопителя или через локальную сеть, нажав на панели Tools/Instrument Manager и следуя указаниям руководства пользователя.
Обработка полученных данных
1. Запустить файл завершенного эксперимента и провести анализ, нажав
2. Перейти во вкладку Analysis, на панели инструментов нажать кнопку Add Analysis ,в появившемся окне выбрать Qualitative detection и нажать OK, в появившемся следом окне также нажать ОК.
3. Нажать кнопку Analysis Settings . В появившемся окне для всех мишеней и ВКО задать значение Minimal EPF = 0.100
4. В таблице с результатами Result Table отобразятся предварительные результаты качественного анализа.
5. Программа автоматически рассчитает значения пороговых циклов Cq.
6. Перейти к этапу анализа результатов.
